重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠IL-12基因质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达。方法：将携带绿色荧光蛋白（GFP）基因质粒（pUV15）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB／c小鼠后2周，处死小鼠，观察肺、脾组织中荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布；将携带GLS和IL-12质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB／C小鼠3次，第1次免疫后4周，处死小鼠，用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达，用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果：在BALB／c小鼠肺、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布，以及GLS的表达，并有血清IL-12水平升高和粘膜特异性SIgA的产生。结论：携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在肺和脾组织分布；携带GLS和IL-12的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫小鼠后，可引起呼吸道粘膜特异性抗菌免疫，以及GLS和IL-12的体内表达，为新型疫苗的研究奠定了基础.     

IL-35重组卡介苗的构建及鉴定

目的构建分泌性表达白细胞介素（IL）-35真核载体pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）-重组卡介苗（BCG）。方法在化学合成的IL-35基因片段中插入pBudCE4.1/GLS/OriM,将合成后序列插入到IL-12真核共表达载体pBudCE4.1/GLS/IL12/OriM的质粒酶切回收产物pBudCE4.1/GLS/OriM中,构建表达IL-35的穿梭/共表达质粒重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）,再以重组质粒电转化到BCG,构建表达IL-35和BCG的重组pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG。结果重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）经PCR扩增、测序鉴定,以及在CHO 293T细胞中表达产物的Western blotting检测,从转录和翻译水平对目标基因产物进行检测验证,pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG在细胞水平经抗酸染色验证,证实基因IL-35正确插入载体pBudCE4.1/GLS/OriM中,且pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG构建成功。结论重组质粒pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG可正确表达IL-35,为进一步研究IL-35功能及其应用价值奠定了良好的基础。     

小鼠单链白细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的:构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗(Bacille calmette-guerin.BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.方法:以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果:电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带.以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96 h后用RT-PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带.结论:成功构建含pBM12的重组BCG.该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因.     

人颗粒溶素活性肽重组卡介苗的构建与表达

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)活性肽的重组卡介苗(BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.方法 以分子生物学方法构建携带GLS活性肽基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBMS,以电转化方式将pBMS质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果 采用电转化方式可将pBMS导入BCG,抽提质粒鉴定出与GLS基因相符的目的 条带.以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96 h后用RT-PCR法可扩增出相应的基因条带.结论 成功构建含pBMS的重组BCG.该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因.     

小鼠单链自细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的：构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗（Bacille calmette—guerin,BCG）,并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。方法：以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT—PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。结果：电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带。以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96h后用RT—PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带。结论：成功构建含pBM12的重组BCG。该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因。     

表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒pMV—ESAT6．经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后．用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc^2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT—PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组（P〈0．05）。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。     

一种新型的表达PPE68蛋白的重组耻垢分枝杆菌载体疫苗的构建及鉴定

目的:构建一种新型的、含结核分枝杆菌(M.S)抗原PPE68的耻垢分枝杆菌载体疫苗.方法:以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组为模板,PCR方法获得Rv3873基因,然后通过克隆构建获得真核表达质粒pVAX-1-Rv3873,最后通过电转化的方法将pVAX1-Rv3873真核表达质粒转化至耻垢分枝杆菌的感受态细胞中获...     

表达人白细胞介素-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立

目的建立表达人IL-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治膀胱癌打下基础.方法分别从中间质粒pY6013和pIJK-1中克隆出分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)启动子和堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽,再从质粒pHIG53中利用PCR扩增出不含信号肽的IL-2cDNA,利用分枝杆菌质粒pRR3构建IL-2分枝杆菌穿梭表达载体并使IL-2在其中分泌表达.将重组质粒电转化到耻垢分枝杆菌中建立重组耻垢分枝杆菌疫苗株.连续传代培养观察重组菌株的稳定性.Western blot和IL-2活性测定等方法观察IL-2的表达及其活性.结果经测序表明HSP70、α抗原信号肽及IL-2的序列及读码框架均正确.Western blot及IL-2活性检测表明在重组耻垢分枝杆菌上清中有IL-2表达,其生物活性为118.5 U/ml(细菌浓度为5×105CFU/ml,其培养时间为36 h).结论成功建立了分泌人IL-2的重组耻垢分枝杆菌,为进一步防治膀胱肿瘤的复发奠定了基础.     

重组耻垢分枝杆菌联合抗痨药物对鼠结核病治疗作用的探讨

目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠IL-12基因的重组耻垢分枝杆菌(M.smegmatis,MS)与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果.方法:将结核分枝杆菌H37Rv感染的Balb/c小鼠40只随机分成4组.感染4周后分别用生理盐水、重组MS、INH+PZA和重组MS联合INH+PZA治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果:重组MS联合INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(lg CFU/g)比重组MS和INH+PZA治疗组显著降低;重组MS和INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低.重组MS组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组.重组MS联合INH+PZA治疗组和重组MS组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组.重组MS和INH+PZA组病变轻且局限,生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛.重组MS联合INH+PZA治疗组肺组织病变最轻.结论:GLS/IL-12重组MS对小鼠结核病有一定免疫治疗作用;重组MS联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效.     

耻垢分枝杆菌疫苗经灌胃免疫在小鼠体内的分布与安全性研究

目的 探讨携带编码幽门螺杆菌UreB基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.s)经灌胃免疫在小鼠体内的分布和安全性.方法 将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌灌胃BALB/c小鼠后8周,处死小鼠,观察胃、心、肝、脾、肺和肾组织中荧光蛋白的分布,测定小鼠肌酐及ALT;处死小鼠,分离出肺、肾、肝并分别测定其重量及HE染色.结果 在BALB/c小鼠胃、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白的表达,其他组织及对照组未检测到绿色荧光;小鼠体质量、各脏器质量、各血清肌酐和ALT含量与对照组无差异(P>0.05).结论 携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在胃和睥组织分布,对小鼠无系统毒性作用.     

人颗粒溶素活性肽和小鼠白细胞介素-12基因真核穿梭共表达质粒的构建与真核表达

目的 构建含分枝杆菌复制子Orim,可分泌表达人颗粒溶素相对分子质量为9 000的活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核穿梭共表达质粒,并检测其蛋白表达.方法 以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9 000的颗粒溶素活性肽基凶片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段测序对质粒进行鉴定.同时,将mIL-12哑克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE41-S9K/mIL-12.然后,将分支杆菌复制子Orim亚克隆入真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,形成穿梭共表达质粒.采用RT-PCR、免疫细胞化学法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.ELISA检测mIL-12的表达.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达.结论 成功构建穿梭共表达质粒pBM9,并能体外表达.     

9 ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达

目的:构建能分泌表达人9 ku颗粒溶素(granulysin)的真核质粒,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础.方法:以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR,双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.结果:成功扩增出含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9 ku颗粒溶素.结论:成功构建能分泌表达9 ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1-S9K.     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis,Mtb)PPE68基因的真核表达质粒,观察PPE68基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法:将MtbPPE68基因克隆亚至真核表达质粒pBudCE4.1中,构建真核表达质粒pBudCE4.1-PPE68.以真核表达质粒pBudCE4....     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的:克隆人天然颗粒溶素(granulysin,GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体,观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法:提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA,经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列,插入pEGFP-C1质粒,鉴定正确后转染RAW264.7细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白及GLS的表达,采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性.结果:成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA,经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达,表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达,其表达产物具有良好的免疫反应性.     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

tPA和VEGF165基因共表达质粒的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建携带人组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮细胞生长因子165(VEGFl65)基因的真核表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165,并观察其在血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达。方法从人心脏组织中克隆tPA和VEGF165基因。将tPA和VEGF165基因克隆至真核表达质粒pBudCE4．1中,构建共表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165。将pBudCE4．1／tPA-VEGF165转染VSMC,用RT-PCR法检测转染的VSMC中tPA和VEGFl65mRNA的表达,用ELISA法检测转染的VSMC培养液中tPA和VEGF165蛋白质。结果人tPA和VEGF165基因的RT-PCR产物分别为1．9kb和576bp。经酶切鉴定证实,tPA和VEGF165基因已克隆至真核表达质粒pBudCE4．1中。以其转染VSMC后,经RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达。结论成功地构建了真核共表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165,并在VSMC中表达tPA和VEGF165。     

慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.