糖尿病大鼠早期视网膜小胶质细胞活化与神经节细胞损害的关系

目的　观察糖尿病早期视网膜小胶质细胞的活化特征与视网膜神经节细胞（RGC）损害的关系。方法　20只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,采用链脲佐菌霉素腹腔注射方法制作糖尿病动物模型,分为糖尿病1、3个月组及相应正常对照组,每组5只大鼠。对所有大鼠行上丘定位注射逆行标记RGC,分别用免疫组织化学法标记视网膜铺片、冰冻切片小胶质细胞和RGC,共聚焦显微镜下观察小胶质细胞细胞形态及分布特征。结果　糖尿病组视网膜铺片小胶质细胞胞体增粗,形态不规则。与对照组相比,糖尿病3个月组RGC层发生吞噬的小胶质细胞密度显著增加（t=3.83,P＜0.01）。与对照组相比,糖尿病大鼠1、3月个组RGC层小胶质细胞平均密度均显著增加（t=2.71,4.22;P＜0.05）;糖尿病大鼠3个月组RGC层小胶质细胞平均密度较糖尿病1个月组显著增加（t=7.45,P＜0.0001）。糖尿病早期小胶质细胞与RGC数量之间存在相关关系（r=0.9,P＜0.05）。结论　糖尿病早期小胶质细胞活化与RGC损伤关系密切。     

动态对比增强磁共振定量检测糖尿病视网膜病变血视网膜屏障渗漏的实验研究

目的　利用动态对比增强磁共振（DCE-MRI）定量检测实验性糖尿病视网膜病变（DR）血视网膜屏障（BRB）破坏程度,并探讨其可行性。方法　40只鼠龄3周的健康Sprague-Dawley （SD）大鼠随机平均分为实验组和正常对照组,实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素,注射48、72 h后检测大鼠空腹血糖及尿糖,血糖浓度在16.65 mmol/L、尿糖(+++)以上者视为建模成功,并按病程再分为糖尿病2、4、6、8个月,组每组各5只大鼠。正常对照组腹腔注射等体积缓冲液,并根据与实验组大鼠年龄匹配原则再平均分为4组,每组大鼠5只。分别在注射后2、4、6、8个月时利用DCE MRI扫描眼球,计算BRB渗漏速度;戊巴比妥过量麻醉后摘除眼球观察视网膜组织形态。采用SPSS 12.0对数据进行统计学分析。结果 　实验组大鼠成模率100%,正常对照组、糖尿病2、4个月组大鼠BRB未见明显渗漏,糖尿病6、8个月组大鼠BRB渗漏速度分别为(0.1399±0.0065)、(0.1816±0.2756) mm³/min,两者之间差异有统计学意义（Z=-2.121,P＜0.05）。实验组大鼠病程4个月时出现明显视网膜组织水肿,细胞排列紊乱,随病程延长逐渐加重,出现血管扩张,出血。结论　DCE MRI能够较精确地检测实验性DR的BRB渗漏速度,定量化评价BRB的破坏程度。      

蛋白酶体抑制剂对糖尿病大鼠视网膜病变激活核转录因子-κB信号通路及视网膜神经节细胞凋亡的作用

目的　观察泛素蛋白酶体抑制剂对早期糖尿病性视网膜病变(DR)中激活核转录因子（NF-κB）和其抑制性信号蛋白IκB激酶的降解调控作用,及其对视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的影响。方法　健康成年雄性Wistar大鼠40只,用数字随机法随机分为正常对照组（A组）、DR安慰剂组（B组）、DR+蛋白酶体抑制剂（MG132）低浓度干预组（C组）,DR+MG132高浓度干预组（D组）,每组10只大鼠。给药后6、8周,检测每组大鼠体重、血糖,并制备视网膜石蜡切片,采用免疫组织化学法分析NF-κB及其抑制性信号蛋白IκB在大鼠视网膜中的表达。采用原位凋亡检测（TUNEL）法分析RGC的凋亡情况。结果　NF-κB在B组表达较A组明显增强,D组表达强度较B组减弱;IκB在B组表达较A组明显减少,D组表达强度较B组增强;RGC凋亡在B组的表达较A组明显增多,D组表达强度较B组减少;差异均有统计学意义(P＜0.01)。C组NF-κB和IκB的表达强度及RGC凋亡与B组相比,差异均无统计学意义(P＜0.05)。结论　泛素蛋白酶体抑制剂MG132通过抑制 IκB泛素化降解,阻断NF-κB激活,抑制RGC的凋亡。      

色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的　观察色素上皮衍生因子（PEDF）对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶（GS）表达的影响。方法　将Sprague-Dawley大鼠分为模型组、模型对照组、PEDF干预组（干预组）、干预对照组,每组均为8只大鼠。模型组、干预组、干预对照组大鼠链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠,干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF 10 μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液。采用免疫组织化学法和实时荧光聚合酶链反应（PCR）法检测视网膜GS和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达变化。将视网膜Müller细胞置于高糖环境下培养,实验干预组中加入100 ng/ml PEDF,空白对照组加入相同容积的培养液,24 h后通过蛋白质免疫印迹（Western blot）法和实时荧光PCR法检测PEDF对Müller细胞GS和IL-1β表达的改变。流式细胞仪锚定蛋白-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶（Annexin V-FITC-PI）双染色法检测100ng/mlPEDF对高糖状态下Müller细胞凋亡的影响。结果　实时荧光PCR法从基因水平和免疫组织化学法从蛋白质水平检测均显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GS表达降低,而IL-1β的表达升高,实时荧光PCR法：GS: t=4.23, P＜0.01;IL-1β: t=16.73,P＜0.01;免疫组织化学法：GS:t=5.13,P＜0.01;IL-1β: t=9.32, P＜0.01;干预组大鼠玻璃体腔注射PEDF 48 h后,IL-1β的表达下降,GS的表达升高,与干预对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=3.87,P＜0.01;IL-1β: t=3.61,P＜0.05;免疫组织化学法：GS:t=3.32, P＜0.05;IL-1β: t=2.63, P＜0.05。在高糖环境下,通过实时荧光PCR法和Western bot 法检测均显示PEDF可以下调IL-1β的表达,而上调GS的表达,与空白对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=2.89, P＜0.05;IL-1β: t=3.37, P＜0.05;Western blot：GS: t=2.66, P＜0.05;IL-1β: t=3.23, P＜0.05。流式细胞仪检测结果显示,PEDF可以抑制高糖环境下Müller细胞的凋亡,实验组凋亡率与空白对照组凋亡率比较,差异有统计学意义(t=3.21,P＜0.05)。结论　对于糖尿病大鼠,PEDF可能通过下调视网膜Müller细胞中IL-1β的表达来上调GS的表达,从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡      

αA-晶体蛋白在2型糖尿病大鼠神经视网膜的异常表达

目的　用蛋白质组学方法观察αA-晶体蛋白在早期2型糖尿病大鼠神经视网膜的异常表达。方法　28 只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组,每组14只。糖尿病组大鼠采用高脂饮食饲养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)注射诱导2型糖尿病模型(T2DM),以随机血糖持续高于16.7 mmol/L为模型建立成功标准。对照组用常规饲料喂养,腹腔注射相同剂量枸橼酸钠缓冲液。成模56 d 后断颈处死所有大鼠,剥离留存神经视网膜组织。从对照组和糖尿病组各取3只大鼠的神经视网膜组织,提取总蛋白,用二维凝胶电泳（2-DE）方法分别进行分离。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱 (MALDI-TOF-MS/MS) 和肽质量指纹图谱 (PMF) 技术对部分差异表达蛋白进行鉴定,并用蛋白免疫印迹（Western blot）和间接免疫荧光（IMF）方法对在糖尿病组表达上调的αA-晶体蛋白进行验证。结果　平均每块凝胶检测到的蛋白斑点,对照组为（3122±37）,糖尿病组为（2702±21）个。二者比较,表达水平差异有统计学意义的斑点约150个（t值均＞2.57,P值均＜0.05）。在糖尿病组表达上调68个,表达下调82个。质谱分析和数据库检索鉴定出 20个差异表达蛋白斑点。其中二维凝胶中2369和1048斑点在糖尿病组呈现高表达。经质谱PMF鉴定为αA-晶体蛋白。Western blot 检测结果显示,αA-晶体蛋白在糖尿病组大鼠神经视网膜表达明显增高。IMF 结果显示 αA-晶体蛋白在糖尿病组高表达,阳性表达主要位于视网膜的内外核层,在细胞的核周细胞浆区域有强荧光聚集。结论　αA-晶体蛋白在早期2型糖尿病大鼠神经视网膜表达增高。      

基于丝裂原活化蛋白激酶信号通路灯盏细辛对大鼠急性高眼压的缓解及视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察灯盏细辛（EBHM）调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路对大鼠急性高眼压的影响及视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用。方法:雄性Sprague-Dawley大鼠60只,采用随机数字表法分为对照组、模型组、EBHM低剂量组（A组）、EBHM中剂量组（B组）、EBHM高剂量组（C组）,每组均为12只;以左眼...     

缺氧诱导因子1α对早期糖尿病视网膜病变状态下人粒细胞系白血病细胞表面黏附分子CD18表达的调节

目的　观察在早期糖尿病视网膜病变(DR)状态下,缺氧诱导因子1α（HIF-1α）对细胞表面黏附分子CD18表达以及白细胞和血管内皮细胞黏附的影响。方法　收集早期DR患者及年龄匹配的健康人外周血血清,用于体外培养人粒细胞系白血病细胞（HL60）和恒河猴视网膜血管内皮细胞系细胞（RF/6A）。分为糖尿病血清培养组（B组）、糖尿病＋HIF 1α反义寡核苷酸组（ASODN）（C组）、糖尿病＋HIF 1α 正义寡核苷酸组（SODN）（D组）,健康人血清培养细胞为正常对照组（A组）。以流式细胞仪和Real-time PCR分别检测HL60细胞表面CD18蛋白阳性细胞比例和CD18 mRNA的表达水平,以虎红染色法观察HL60细胞和RF/6A细胞的黏附率。结果　A、B、C、D组CD18阳性细胞比例分别为17.06±6.01、42.23±2.60、25.33±3.05、32.40±10.57,各组之间差异有统计学意义（F=36.47,P＜0.001）。和A组比较,B、C、D组CD18 mRNA水平分别是A组的21.05±2.07、2.23±0.96、25.07±2.27倍,各组之间差异有统计学意义（F＝180.34,P＜0.001）。A、B、C、D组细胞黏附率分别为0.06±0.002、0.09±0.10、0.05±0.007、0.07±0.01,各组之间差异有统计学意义（F=13.06,P=0.002）。结论　在体外培养条件下,糖尿病血清可以促进HL60细胞表达CD18蛋白和CD18mRNA,促进HL60细胞和血管内皮细胞的黏附,HIF-1α表达被抑制后,这种促进作用减弱。HIF-1α对糖尿病状态下细胞表面黏附分子CD18表达及白细胞和血管内皮细胞之间的黏附具有调节作用。      

抑制JAK/STAT信号通路对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞的保护作用及对谷氨酸转运蛋白表达的影响

目的　探讨JAK/STAT信号通路对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞及对谷氨酸转运蛋白（glutamate transporter，GLAST）表达的影响。方法　雄性SD大鼠30只，随机分成对照组、糖尿病组、AG490组，每组10只。后两组大鼠采用单次腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 50 mg·kg^-1诱导糖尿病模型。模型诱导成功后，AG490组给予AG490 10 μL（17 mmol·L^-1）玻璃体内注射给药。注射1个月后，利用试剂盒检测3组大鼠视网膜中谷氨酸含量变化，免疫荧光检测视网膜GLAST表达，免疫组织化学检测视网膜p-JAK2表达，Western blot检测视网膜GLAST、p-JAK2及p-STAT3蛋白相对表达量。结果　与对照组GLAST相对表达量（65.35±0.66）%、p-JAK2相对表达量（32.80±0.40）%、p-STAT3相对表达量（17.62±1.09）%、谷氨酸含量（23.93±0.67）μmol·g^-1相比，糖尿病组视网膜p-JAK2相对表达量（52.16±0.62）%、p-STAT3相对表达量（47.41±0.95）%及谷氨酸含量（44.88±0.27）μmol·g^-1均明显增加，GLAST相对表达量（32.96±0.64）%明显下降（均为P<0.01）；而与糖尿病组相比，AG490组p-JAK2相对表达量（13.67±0.45）%、p-STAT3相对表达量（14.47±0.25）%及谷氨酸含量（25.18±0.66） μmol·g^-1均明显降低，GLAST相对表达量（49.48±0.32）%明显增加（均为P<0.01）。结论　糖尿病早期大鼠视网膜GLAST表达明显降低，抑制JAK/STAT通路的活化可上调视网膜GLAST表达，降低视网膜谷氨酸含量，这可能有助于减轻糖尿病状态下视网膜Müller细胞的损伤。     

早期糖尿病大鼠视网膜神经节细胞树突形态异常的研究

目的观察早期糖尿病大鼠视网膜上存留的视网膜神经节细胞(RGC) 树突和胞体形态改变。方法用基因枪技术标记病程3个月的糖尿病大鼠和正常同龄大鼠的RGC，用带Z轴的Leica显微镜和CCD照相机采集RGC照片，按树突和胞体大小及形态分类后比较各组细胞树突野、胞体直径变化及其结构特征变异。Thy-1抗体免疫标记RGC，荧光显微镜下拍照，计数比较早期糖尿病大鼠RGC密度变化。结果病程3个月时，糖尿病大鼠RGC密度明显下降，被基因枪标记的RGC出现明显的树突野变化。各类细胞树突主干没有很大的变异，部分RGC表现出局部树突的短缩破坏，部分RGC细胞表现为树突小分支稀疏或扭曲变形。糖尿病大鼠A类RGC的树突野直径均值为(401±86) μm,对照组大鼠A类RGC的树突野直径均值为（315±72） μm,二者比较，差异有统计学意义（t=21.249，P<0.001)；糖尿病大鼠A类RGC的胞体直径均值为(24±6) μm, 对照组大鼠A类RGC的胞体直径均值为（22±5） μm,二者比较，差异无统计学意义（t=0.927，P>0.05)。B类RGC树突野与胞体直径均值在糖尿病大鼠分别为（170±36）、（14±2） μm，在对照组大鼠分别为（165±36）、（16±2） μm； C类 RGC树突野与胞体直径均值在糖尿病大鼠分别为（265±78）、（17±5） μm，在对照组大鼠分别为（251±57）、（17±4） μm，两两比较，其差异均无统计学意义（t= 1.357，0.798，0.835，1.104，P>0.05）。结论糖尿病早期大鼠RGC树突具有相当的可塑性，尤其是A类细胞。树突形态变化比胞体更敏感，可作为早期RGC形态变化的重要指标。糖尿病成年动物RGC表现出良好的可塑性及从树突变化到细胞真正死亡之间存在的时间窗为我们研究及临床开展神经保护提供了依据。 （中华眼底病杂志，2008，24：249-254）     

沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)调控p38MARK信号通路对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及机制

目的 探讨沉默信息调节因子相关酶1(silment information regulator factor related enzymes 1,SIRTl)对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的保护作用及其机制.方法 取健康清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠60只,应用随机数字表法分为正常对照组(正常组)、糖尿病组(病变组)、SIRT1激动剂白藜芦醇治疗组(治疗组).病变组和治疗组大鼠按60 mg·kg-1单次腹腔注射链脲佐菌素以诱导糖尿病大鼠模型;正常组按60 mg· kg-1腹腔注射枸橼酸钠缓冲液.72h后取鼠尾静脉血检测血糖,血糖值＞16.7 mmol·L-1定为糖尿病大鼠.自造模成功后第2天起治疗组每天每只鼠给予白藜芦醇20 g·kg-1灌胃,正常组和病变组每天每只鼠给予亚甲砜灌胃.8周后进行视网膜免疫组织化学染色,TUNEL法检测视网膜RGCs凋亡,Western blot检测SIRT1、p38 MAPK、Caspase-3蛋白的表达.结果 正常组、病变组、治疗组8周后RGCs凋亡指数分别为:(0.848±0.131)％、(19.038±1.327)％、(10.461±1.089)％,三组间差异有统计学意义(F=670.497,P=0.000).进一步两两比较:正常组RGCs凋亡指数与病变组、治疗组间差异均有统计学意义(均为P=0.000);治疗组与病变组间差异亦有统计学意义(P =0.000).与正常组(0.132±0.003)相比,病变组(0.060±0.028)和治疗组(0.073±0.026)大鼠视网膜SIRT1蛋白表达降低,总体差异有统计学意义(F=1310.663,P=0.000).进一步两两比较,病变组和治疗组与正常组间,以及病变组与治疗组间差异均有统计学意义(均为P =0.000).病变组(l.121±0.082,0.266±0.005)和治疗组(0.574±0.012,0.190±0.060)大鼠视网膜p38 MAPK、Caspase-3蛋白表达较正常组(0.402±0.012,0.156±0.006)明显增加,总体差异有统计学意义(F =604.500、1056.709,P=0.000、0.000).进一步两两比较:p38 MAPK、Caspase-3蛋白表达在正常组与病变组间、正常组与治疗组间以及病变组与治疗组间差异均有统计学意义(均为P=0.000).结论 在糖尿病视网膜病变模型中,SIRT1表达上调,抑制RGCs的凋亡,对糖尿病视网膜病变RGCs起保护作用.其抗凋亡作用机制可能与其抑制p38 MAPK的表达相关.p38 MAPK信号通路是糖尿病视网膜病变中SIRT1介导的神经保护作用的重要通路之一.     

Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP)对糖尿病大鼠视网膜神经损伤的保护作用

目的　探讨Raf-1激酶抑制蛋白(raf-1 kinase inhibitory protein,RKIP)通过p38-MAPK通路对糖尿病(DM)大鼠视网膜神经损伤的保护作用。方法　雄性SD大鼠48只,采用随机数字表法将大鼠分为对照组、空白组、糖尿病组、RKIP组,每组12只;空白组、糖尿病组和RKIP组大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立DM模型。RKIP组和空白组于模型建成第2周玻璃体内分别注射携带RKIP基因片段重组慢病毒(LV-RKIP)和等量空白病毒,对照组和糖尿病组注射等量生理盐水。注射10周后利用Western blot和免疫荧光化学检测各组RKIP、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase,p38-MAPK) 、胶质细胞谷氨酸转运体(L-glutamate/L-asparate transporter,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)在视网膜中的表达,HE染色检测各组视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)密度。结果　与对照组相比,糖尿病组p38-MAPK表达升高,RKIP、GLAST、GS表达下降,RGC密度减少(均为P<0.01);与糖尿病组相比,空白组各指标差异均无统计学意义(均为P>0.05),RKIP组p38-MAPK表达降低,RKIP、GLAST、GS表达升高,RGC密度增多(均为P<0.01)。结论　糖尿病视网膜病变早期注射RKIP可降低视网膜细胞中p38-MAPK表达量,提高GLAST、GS表达活性,改善Müller细胞功能,减少RGC损害,提示RKIP对糖尿病视网膜病变中视网膜神经细胞具有保护作用。     

玻璃体腔注射环孢菌素A对糖尿病大鼠血视网膜屏障的保护作用及机制

目的 观察和探讨玻璃体腔注射环孢菌素A(CsA)对糖尿病(DM)大鼠血视网膜屏障(BRB)的影响及其作用机制.方法 8～10周龄健康Sprague-Dawley雄性大鼠48只,随机分为正常对照组、DM组、CsA组及二甲基亚砜(DMSO)组,每组12只.对DM、CsA及DMSO组大鼠进行一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液建模,正常对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液.注射后72h,采用免疫组织化学染色法检测视网膜内外渗的内源性白蛋白评价BRB的渗透性;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测视网膜细胞间粘附分子(ICAM-1)的蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测视网膜血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 与正常对照组相比,DM组大鼠视网膜外渗的白蛋白增多,视网膜内ICAM-1、VEGF表达明显升高,差异均有统计学意义(F=29.350,29.240,9.658;P＜0.01).与DM组相比,CsA组大鼠视网膜外渗的白蛋白减少,视网膜内ICAM-1、VEGF表达明显下降,差异均有统计学意义(t=3.174,5.000,3.352;P＜0.05);DMSO组大鼠视网膜外渗的白蛋白、视网膜内ICAM-1及VEGF表达均无明显变化,差异无统计学意义(t=0.420,0.561,0.312 ;P＞0.05).结论 玻璃体腔注射CsA对DM大鼠BRB具有保护作用.其机制可能与CsA降低ICAM-1及VEGF的表达有关.     

洛美利嗪对糖尿病早期大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的： 探讨洛美利嗪(lomerizine,LOM)对糖尿病早期大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡的保护作用及其机制。

方法： SD大鼠随机分为对照组(CON)、糖尿病组(DM)及洛美利嗪组(LOM),每组40只大鼠。DM和LOM组链脲佐菌素(STZ)按60mg/kg一次性腹腔注射诱导糖尿病模型,CON组给予等量无菌柠檬酸钠溶液腹腔注射。LOM组于糖尿病鼠模型成模后,每日予LOM 60mg/kg灌胃,CON组和DM组采用等量生理盐水灌胃。于第4,8,12wk分别行HE、透射电镜、TUNEL检测RGCs的凋亡情况,同时采用激光共聚焦显微镜检测RGCs内钙离子的浓度。

结果：(1)形态学观察：随病程延长,逐渐出现RGCs数量减少、细胞排列紊乱的病理改变。透射电镜下可见DM组RGCs出现不同阶段的凋亡征象,且随病程延长逐渐加重。LOM组与同期DM组对比,在第8,12wk时RGCs凋亡征象减弱。(2)TUNEL检测：CON组大鼠视网膜神经节细胞层未见凋亡细胞。DM组4wk时视网膜神经节细胞层偶见TUNEL 阳性细胞,并随病程延长逐渐增多,凋亡指数与同期CON组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。LOM 组8,12wk时,与同期DM组比较,染色阳性的RGCs明显减少,凋亡指数明显下降,差异显著(P<0.01)。(3)激光共聚焦显微镜钙离子浓度检测：DM组与同期CON组比较：DM组8,12wk 的RGCs内钙离子荧光染色强度明显升高,有显著差异(P<0.01)。LOM组与同期DM组比较：LOM 组8,12wk的RGCs内钙离子荧光染色强度明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。

结论：LOM对糖尿病大鼠早期RGCs的凋亡具有保护作用。     

糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与锰超氧化物歧化酶活性及mRNA表达变化的关系

目的 探讨糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与锰超氧化物歧化酶(MnSOD)活性及mRNA表达变化的关系.方法 对照实验研究.健康雄性8周龄SD大鼠72只,分为正常对照组及糖尿病组.糖尿病组大鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg体重,以诱导糖尿病大鼠模型;建模成功后再于建模后4、8、12周3个时间点分为3组,每组各12只大鼠.正常对照组不进行干预,与糖尿病组大鼠同时饲养,也按相同时间点分为4、8、12周3组,每组各12只大鼠.采用TdT介导DNA缺口末端的dUTP标记(TUNEL)法检测视网膜神经细胞凋亡指数,免疫组织化学方法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达水平,黄嘌呤氧化酶法检测MnSOD及铜一锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)活性,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测MnSOD mRNA、Cu-ZnSODmRNA及easpase-3 mRNA表达情况.正常对照组与糖尿病组大鼠各时间点视网膜神经细胞凋亡指数、视网膜caspase-3 mRNA表达水平、Cu-ZnSOD和MnSOD活性及mRNA表达水平比较,均采用两因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验法.结果 (1)正常对照组4、8、12周大鼠视网膜均未见神经细胞凋亡.糖尿病组大鼠于建模后4周即出现神经细胞凋亡,凋亡指数为(0.5±1.5)%;8和12周大鼠神经细胞凋亡指数为(5.7±3.9)%和(11.8±5.1)%.糖尿病组与正常对照组大鼠各时间点视网膜神经细胞凋亡指数差异有统计学意义(F=19.5412,P＜0.05).进一步两两比较,8和12周糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡指数较同期正常对照组大鼠均明显升高(均P=0.000).(2)正常对照组4、8、12周大鼠视网膜均未见caspase-3蛋白阳性表达,糖尿病组大鼠4周即可见caspase-3蛋白阳性表达,8和12周时表达增强.正常对照组4、8、12周大鼠caspase-3 mRNA表达RQ值分别为1.649±0.586、1.526±0.486及1.614±0.296;糖尿病组4、8、12周大鼠caspase-3 mRNA表达RQ值分别为5.672±1.193、12.566±2.272及14.297±2.11;正常对照组与糖尿病组大鼠各时间点视网膜caspase-3 mRNA表达RQ值差异有统计学意义(F=105.175,P＜0.05).进一步两两比较,糖尿病组大鼠各时间点视网膜caspase-3 mRNA表达RQ值均较同期正常对照组明显升高(均P=0.000).(3)正常对照组4、8、12周大鼠MnSOD活性分别为(47.118±5.018)、(46.033±6.835)及(45.813±6.859)U/mg,MnSOD mRNA表达RQ值分别为0.973±0.123、0.974±0.085及0.994±0.074,CuZnSOD活性分别为(113.884±9.07)、(112.301±5.24)及(117.52±7.982)U/mg,Cu-ZnSOD mRNA表达RQ值分别为1.067±0.109、1.055±0.119及1.092±0.180.糖尿病组4、8、12周大鼠MnSOD活性分别为(33.863±6.909)、(22.877±7.875)及(20.034±6.796)U/mg,MnSOD mRNA表达RQ值分别为0.627±0.083、0.333±0.080及0.256±0.057;8和12周大鼠Cu-ZnSOD活性分别为(98.588±9.212)和(78.168±12.180)U/mg,Cu-ZnSOD mRNA表达RQ值为0.829±0.048和0.621±0.033.正常对照组与糖尿病组大鼠各时间点视网膜MnSOD、Cu-ZnSOD活性及mRNA表达RQ值差异有统计学意义(MnSOD:活性F=19.709,P＜0.05;mRNA F=93.352,P＜0.05;Cu-ZnSOD:活性F=16.708,P＜0.05;mRNA F=16.332,P＜0.05).进一步两两比较,糖尿病组大鼠各时间点视网膜MnSOD、Cu-ZnSOD活性及mRNA表达RQ值均较同期对照组明显下降(MnSOD活性:4周P=0.002,8和12周均P=0.000;MnSOD mRNA:4、8、12周均P=0.000;Cu-ZnSOD活性:8周P=0.011,12周P=0.000;Cu-ZnSOD mRNA:8周P=0.001,12周P=0.000).结论 糖尿病早期视网膜神经细胞凋亡可能与MnSOD活性及MnSOD mRNA表达水平下降有关.