呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞诱导氧化应激对TLR7基因及其下游因子表达的影响

目的 观察呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺上皮细胞(A549细胞)引起的氧化应激对Toll样受体7(TLR7)活化及其主要信号分子的作用,探讨其所介导的抗炎作用和可能的调控机制,为临床治疗和预防RSV感染提供新的思路.方法 RSV体外感染A549细胞为感染组,以抗氧化剂BHA进行预处理作为抗氧化剂组,于感染后的4、8、12、24h收集细胞,以未感染细胞作为正常组.①化学法检测活性氧指标·OH含量的变化;②硝酸还原酶法检测NO含量的变化;③用TRIzol提取细胞总RNA,通过半定量RT-PCR法检测TLR7、白介素(IL-6)的mRNA转录水平的变化;④ELISA法检测细胞上清液中IL-6的表达变化;⑤MTT法检测各组细胞增殖情况.结果 ①感染组里·OH的含量升高并呈时间依赖性,在抗氧化剂组,·OH的含量与感染组相比是降低的;②感染组各时间段NO含量升高并呈时间依赖性,抗氧化剂组的NO含量与感染组同一时间点相比降低;③感染组中不同时间点的TLR7基因转录水平表达上调,抗氧化剂组TLR7的表达虽有上调,表达量都比感染组同时间点下降;④感染组里IL-6的表达量与感染之间有时间依赖性关系,抗氧化剂组IL-6的表达虽有上调,但比感染组同时间点下降;⑤感染组随时间点的延长,细胞抑制率增加,抗氧化剂组的细胞抑制率与感染组相比下调明显.结论 RSV感染可诱导氧化应激的产生,在加入抗氧化剂BHA预处理后,可明显减轻TLR7及其下游主要信号分子的表达变化和细胞抑制率,表明RSV感染活化TLR7及引起细胞损伤可能是通过氧化应激途径来调节的.     

Toll3受体在呼吸道合胞病毒感染中作用的实验研究

目的探讨呼吸道合胞病毒（RSV）感染人肺上皮A549细胞后,Toll样受体3（TLR3）的水平变化及其产生的I型干扰素的抗病毒作用。方法RSV感染体外培养的人肺上皮A549细胞,并给予TLR3特异性抗体处理,分别感染4h、8h、12h、16h和24h后收集各组细胞。未感染病毒的细胞作为对照组。lit—PCR法检测TLR3、IFN-α、IFN—β,RSVF蛋白的mRNA表达水平变化。结果RSV感染A549细胞后,TLR3、IFN—α、IFN-β,RSVF蛋白的mRNA表达量均升高且有时间依赖性。结论RSV感染A549细胞后可上调TLR3表达,其活化细胞介导产生的I型干扰素能起到抗病毒作用。     

呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化TLR7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化,初步研究TLR7活化在RSV感染中介导产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用及其可能的调控机制。方法以RSV滴鼻感染BALB/c鼠建立急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特(Imiquimod)处理,分别于感染后4、8、12、24 h不同时间点处死小鼠取肺组织,并以未感染病毒的BALB/c鼠为正常对照组。①HE染色观察肺的病理学改变;②用TRIzol提取肺组织总RNA,RT-PCR法检测鼠肺内TLR7、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素调节因子7(IRF7),干扰素α(IFN-α),干扰素β(IFN-β)及RSV融合蛋白基因(F基因)mRNA的表达;③Western blot法检测鼠肺组织TLR7蛋白的表达变化;④空斑形成实验(PFU)测定各组不同时间点肺组织匀浆中RSV滴度。结果①HE染色显示肺部炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度随感染时间延长而加重,经Imiquimod干预后肺部炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻;②在mRNA转录水平,RSV感染早期,感染组上调TLR7、IRF3/7、IFN-α/β、RSV F基因的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imi-quimod处理组,TLR7、IRF7、IFN-α的mRNA比感染组相同时间点的表达量明显升高,且升高有显著性差异,而IRF3、IFN-β表达量在Imiquimod干预后与RSV感染组相比升高不明显;而RSV F基因的mRNA表达量较RSV感染组明显下降;③在蛋白水平,RSV感染组上调TLR7蛋白的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imiquimod处理组,TLR7蛋白表达量较感染组显著升高;④RSV感染BALB/c鼠肺后,肺组织匀浆中RSV滴度随感染时间的延长而增加;给予TLR7激动剂Imiquimod处理组,RSV复制滴度水平较感染组明显减少。结论 RSV感染BALB/c鼠后通过活化TLR7,诱导Ⅰ型IFN的产生。用Imiquimod激动TLR7后,Ⅰ型IFN表达量较RSV感染组明显升高,RSV F基因和肺组织匀浆中RSV滴度水平明显减少,以及肺部炎症减轻,表明RSV引起的抗病毒免疫机制与TLR7活化的转导途径有关;而且激动TLR7后,IRF7和IFN-α的表达较IRF3和IFN-β明显升高,表明了IFN-α可能是主要通过IRF7通路由TLR7诱导产生的最主要Ⅰ型IFN。     

呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化Toll样受体7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化及其介导所产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用。方法 48只BALB/c鼠,随机分为正常对照组、RSV感染组、咪喹莫特干预组。以RSV活病毒滴鼻感染BALB/c鼠,诱导急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特处理,分别于感染后4、8、12和24 h不同时间点,用半定量RT-PCR法检测鼠肺TLR7、IFN-α/β、RSV融合蛋白(RSV F蛋白)的mRNA表达,HE染色观察肺的病理学改变。结果①RSV感染早期,TLR7、IFN-α/β、RSV F蛋白的mRNA表达均升高,并与RSV感染之间存在时间依赖性关系;肺的炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度与RSV感染时间相关;②咪喹莫特干预组预先给予TLR7激动剂咪喹莫特处理后,再行相同RSV感染,TLR7、IFN-α/β的mRNA表达量进一步升高,但RSV F蛋白的mR-NA表达下降;肺的炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻。结论 RSV感染可活化上调BALB/c鼠肺组织中TLR7表达,其表达量与感染之间存在时间依赖关系;其介导产生的Ⅰ型IFN起着抗病毒作用,在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,使肺部炎症减轻。     

呼吸道合胞病毒诱导A549细胞凋亡的机制研究

目的:通过呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺Ⅱ型腺上皮癌细胞(A549)及人肺成纤维细胞(IMR-90)后核转录因子(NF-κB)变化,探讨RSV诱导肿瘤细胞凋亡机制,为临床肿瘤治疗提供新方向。方法:RSV以感染复数(MOI)3感染A549及IMR-90细胞,观察感染后24,48,72h细胞形态变化、细胞存活率及细胞内病毒滴度,Western-blot方法检测Caspase-3,8,9蛋白表达变化,并在RSV感染A549细胞后2,4,8,24,36h,采用Western-blot方法检测NF-κB蛋白表达变化。结果:RSV感染A549及IMR-90细胞后,A549细胞存活率较IMR-90低,细胞内病毒滴度较IMR-90高,差异有统计学意义(P<0.05),细胞呈现明显凋亡改变。Caspase-3,8,9呈时间依赖性增强,以Caspase-3,9表达为主。A549细胞内NF-κB表达8h内先增高并达高峰,24h开始下降,36h表达明显下调,与未感染RSV细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:RSV可通过内源性及外源性途径引起A549细胞凋亡,以NF-κB介导的内源性途径为主。     

NS2激活TLR7抑制RSV感染肺泡上皮细胞中IFN的表达

目的 探讨非结构蛋白NS2在呼吸道合胞病毒(RSV)感染人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)活化TLR7信号转导过程中的可能作用.方法 以RSV感染体外培养的A549细胞,设立正常对照组、RSV感染组、RSV NS2小干扰RNA沉默组(NS2 siRNA+ RSV组)及TLR7激动剂组(R848+RSV组).各组分别于病毒感染后的4、12、24、48 h收集细胞和培养上清液.Western blot法检测各组不同时间点TRIF、TRAF6及p-IκB-α蛋白表达;ELISA法检测各组细胞培养上清液中Ⅰ型干扰素α(IFN-α)、IFN-β含量的变化.结果 正常对照组中TRIF、TRAF6、p-IκB-α蛋白的表达量较低,经RSV感染之后,随感染时间增加,表达量升高;在NS2siRNA+ RSV组三者表达量较正常对照组上调,但相对于RSV感染组,表达下降,表明RSV NS2可以活化TRIF、TRAF6及p-IκB-α蛋白的表达.RSV感染组及NS2 siRNA+ RSV组、IFN-α、IFN-β含量随感染时间增加逐渐升高,4h开始升高,差异有统计学意义(P＜0.01);R848+RSV组IFN-α和IFN-β呈时间依赖性增加,感染4h升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NS2在病毒感染A549细胞过程中激活TLR7,抑制了IFN-α和IFN-β的表达.     

呼吸道合胞病毒激活RIG-Ⅰ/TLR3信号通路及对SOCS1/3 mRNA表达的影响

目的:探讨视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)和Toll样受体3(TLR3)两受体在呼吸道合胞病毒(RSV)感染A549细胞后诱导的炎症和抗病毒反应中的作用。方法:应用Real-timePCR方法检测RSV感染A549细胞后0,2,4,8,24hRIG-Ⅰ,TLR3及细胞因子信号转导抑制因子1/3(SOCS1/3)的mRNA的表达水平;用特异性的si-RNA分别抑制RIG-Ⅰ和TLR3两个受体基因的表达,应用Real-timePCR方法检测RSV感染抑制后的A549细胞不同时间点SOCS1/3的mRNA的表达水平。结果:RSV上调RIG-Ⅰ/TLR3两受体及SOCS1/3mRNA的表达(P<0.05);抑制RIG-Ⅰ及TLR3后,SOCS1/3mRNA的表达与对照组相比无差异性(P>0.05)。结论:RSV感染A549细胞后上调负性调节因子SOCS1/3的表达,其表达不依赖RIG-Ⅰ及TLR3受体途径,可能由病毒复制直接诱导。     

呼吸道合胞病毒诱导A549细胞凋亡的机制研究

目的:通过呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺Ⅱ型腺上皮癌细胞(A549)及人肺成纤维细胞(IMR-90)后核转录因子(NF-κB)变化,探讨RSV诱导肿瘤细胞凋亡机制,为临床肿瘤治疗提供新方向。方法:RSV以感染复数(MOI)3感染A549及IMR-90细胞,观察感染后24,48,72h细胞形态变化、细胞存活率及细胞内病毒滴度,Western-blot方法检测Caspase-3,8,9蛋白表达变化,并在RSV感染A549细胞后2,4,8,24,36h,采用Western-blot方法检测NF-κB蛋白表达变化。结果:RSV感染A549及IMR-90细胞后,A549细胞存活率较IMR-90低,细胞内病毒滴度较IMR-90高,差异有统计学意义(P<0.05),细胞呈现明显凋亡改变。Caspase-3,8,9呈时间依赖性增强,以Caspase-3,9表达为主。A549细胞内NF-κB表达8h内先增高并达高峰,24h开始下降,36h表达明显下调,与未感染RSV细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:RSV可通过内源性及外源性途径引起A549细胞凋亡,以NF-κB介导的内源性途径为主。     

呼吸道合胞病毒感染通过上调细胞因子信号抑制因子调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达

目的:研究呼吸道合胞病毒(RSV)对细胞因子信号抑制因子(SOCS)3,Toll样受体(TLR)3、TLR4 mR-NA表达影响,探讨SOCS3在病毒感染上皮细胞后对Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的调节效应。方法:设计人SOCS3特异小干扰RNA(si-RNA),转染上皮细胞A549,RSV感染后不同时段,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测细胞不同时间点细胞SOCS3、TLR3、4 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清中干扰素(IFN)-β和白细胞介素(IL)-8的浓度。结果:RSV感染上调A549细胞TLR3、4和SOCS3 mRNA的表达。SOCS3在感染后1 h升高,2 h达到峰值,分别为0 min的2.1倍和6.2倍(P<0.05),随后逐渐恢复至基础水平;TLR3、4在感染后2 h增加,并在24 h内持续表达较高水平。IL-8于24 h开始增高,24 h较基础水平增加25倍;IFN-β虽增高,但与基础水平无统计学差异。抑制SOCS3,对TLR3、TLR4 mRNA无显著性影响,但早期上调IFN-β的表达,IL-8虽有增高,但显著低于对照组。结论:RSV感染早期通过上调SOCS3表达调节上皮细胞差异表达Ⅰ/Ⅱ型细胞因子。     

利巴韦林抑制呼吸道合胞病毒诱导的A549细胞凋亡

目的:探讨利巴韦林抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用过程中,对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法:将A549细胞分为4个组:细胞对照组(C组)、利巴韦林组(Rib组)、呼吸道合胞病毒组(RSV组)、利巴韦林干预组(RR组),分别在RSV感染的1,2,4,12,24h收集RSV组和RR组培养上清,空斑实验检测各个时间段病毒滴度;应用Western blot技术检测pAKT、AKT、IκBα、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:利巴韦林干预后,pAKT表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);IκBα蛋白4,12,24h表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);Bax蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2蛋白12,24h表达高于RSV组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:利巴韦林不仅可以抑制RSV的复制,同时可以激活AKT-NF-κB途径、上调Bcl-2、下调Bax蛋白表达,从而抑制RSV感染诱导的A549细胞早期凋亡。     

呼吸道合胞病毒对小鼠骨髓树突状细胞Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用

目的研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染对小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)Ⅰ型干扰素(IFN)信号通路的影响。方法从Balb/c小鼠的长骨中分离骨髓细胞,经过培养和刺激后得到BMDCs。将BMDCs接种于6孔板中过夜,然后用不同感染复数(MOI)的RSV感染细胞,用RT-PCR法检测RSV的非结构蛋白-1(NS-1)和非结构蛋白-2(NS-2)基因在BMDCs中表达。在另一组实验中,BMDCs经RSV感染24 h后,分别用IFN-β或IFN-γ刺激,然后收集细胞和提取蛋白,用Western blotting法检测IFN信号通路的STAT1、STAT2及磷酸化的STAT1(P-STAT1)、STAT2(P-STAT2)等蛋白的表达。结果以不同MOI的RSV感染BMDCs 24 h后,RSV NS1和NS2的表达随着感染MOI的增加而逐渐增强,说明RSV病毒能在BMDCs细胞中复制。RSV感染能增加IFN-β信号通路STAT1和STAT2蛋白的表达,但却抑制了P-STAT1和P-STAT2的表达,而紫外线灭活的RSV(UV-RSV)感染对它们的表达却没有影响;而且RSV感染对Ⅱ型IFN(IFN-γ)诱导的STAT1的磷酸化也没有抑制作用。结论RSV感染BMDCs后,能特异性地抑制Ⅰ型IFN诱导的STAT1和STAT2磷酸化,从而抑制Ⅰ型IFN信号通路,这可能是RSV逃避宿主抗病毒免疫的机制之一。     

Semaphorin 7A及其受体在A549细胞转移中的作用

目的 观察SEMA7A及其受体在A549细胞转移中的作用机制。方法 利用小干扰RNA技术检测SEMA7A及其受体Plexin C1相互作用对A549细胞转移及其相关信号通路的影响。结果 SEMA7A及其受体Plexin C1在A549细胞中表达明显高于正常肺泡上皮细胞;SEMA7A增加了肿瘤细胞转移关键因子CCR-7、MMP-2及MMP-9的表达,但当SEMA7A及其受体Plexin C1沉默表达后,CCR-7、MMP-2及MMP-9的表达出现下降,同时A549细胞转移受到明显抑制。结论 SEMA7A及其受体Plexin C1相互作用促进了A549细胞的转移。     

呼吸道合胞病毒(RSV)对干扰素(IFN)信号通路STAT蛋白核转移的影响

 目的 研究呼吸合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染小鼠骨髓树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)后,对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(interferon,IFN)诱导的JAK/STAT通路蛋白活化后核转移的影响。方法 从BALB/c小鼠的长骨中分离骨髓细胞,经过培养和刺激后得到BMDCs。将BMDCs接种于带小室的玻片上,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1的RSV感染细胞,并设紫外线灭活的RSV(UV-RSV)和培养液(media)刺激为对照。在培养24 h后,分别用100 IU/mL的IFN-β刺激30 min或0.64 pmol/L的IFN-γ刺激45 min,然后进行免疫荧光染色。在荧光显微镜下计数STAT蛋白核转移阳性细胞的百分比,比较各组间的差异。结果 在未感染的BMDCs中,STAT1和STAT2蛋白主要存在于细胞质中,当用IFN-β 刺激BMDCs后可见到明显的STAT1和STAT2蛋白向细胞核转移,核转移阳性细胞百分比分别为89.0%±4.6%和83.7%±5.1%,与未处理组(NT组)相比有明显差异(P<0.01)。而RSV感染后,发现STAT1和STAT2蛋白核转移阳性细胞数较IFN-β 刺激组明显减少(P<0.01),说明RSV感染可以抑制IFN-β诱导的STAT1和STAT2蛋白的核转移。而应用UV-RSV感染后与IFN-β刺激组相比,STAT1和STAT2蛋白核转移阳性细胞数却未见明显减少(P>0.05)。用IFN-γ 刺激BMDCs后也可见到明显的STAT1蛋白向细胞核转移(阳性细胞为85.3%±6.4%);而RSV感染后与IFN-γ刺激组相比,STAT1核转移阳性细胞数(79.3%±4.9%)却未见明显减少(P>0.05)。结论 RSV感染BMDCs后,能特异性地抑制Ⅰ型IFN诱导的STAT1和STAT2蛋白的核转移,而对II型IFN诱导的STAT1蛋白的核转移却没有影响。     

Mortality in children hospitalised with respiratory syncytial virus infection in Singapore

INTRODUCTIONThis study aimed to investigate the trend and seasonality of infection due to respiratory syncytial virus (RSV) at KK Women’s and Children’s Hospital (KKH) in Singapore and to examine the risk factors for mortality among children with RSV infection requiring admission to the paediatric intensive care unit (PICU).METHODSA retrospective study was conducted at KKH on children with RSV infections who were admitted to the PICU between January 2004 and December 2010. The medical records of children who died from RSV infections were reviewed. Linear regression was performed to determine the risk factors for RSV mortality.RESULTSRSV infection was documented in 5,785 children during the study period; the infection was noted to be occurring throughout the year, with a small increase in prevalence between the months of June and August every year. Among 85 (1.5%) out of 5,785 children who were admitted to the PICU for RSV infection, 74 (1.3%) survived and 11 (0.2%) died. Multivariate logistic regression analysis showed that haemodynamically significant cardiac disease (odds ratio [OR] 12.2, 95% confidence interval [CI] 0.9–16.7, p = 0.05), immunodeficiency (OR 71.4, 95% CI 8.2–500, p < 0.001) and metabolic disease (OR 71.4, 95% CI 4.3–1,000, p = 0.003) were independent risk factors for mortality in RSV infections. Prematurity increased the risk of admission to the PICU but was not significantly associated with mortality.CONCLUSIONChildren with haemodynamically significant cardiac disease, immunodeficiency and metabolic disease were at higher risk of death after hospitalisation for RSV-related illnesses. These children should be considered for palivizumab prophylaxis.     

呼吸道合胞病毒感染对鼻黏膜下成纤维细胞分泌趋化因子的影响

[目的]了解呼吸道合胞病毒（RsV）感染对鼻黏膜下成纤维细胞分泌趋化因子的影响．[方法]取手术切除的下鼻甲鼻黏膜进行上皮细胞及黏膜下成纤维细胞培养,将RSV感染鼻黏膜上皮细胞后,用其培养上清液刺激培养的成纤维细胞,用荧光定量PCR分别于6,12,24,48h时测定嗜酸细胞活化趋化因子、调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES）、白细胞介素8（IL－8）及生长调节癌基因α（GRO—α）的mRNA表达程度;用ELISA方法分别于24,48h测定培养液中嗜酸细胞活化趋化因子、RANTES,IL-8,GRO-α蛋白质的含量．[结果]实验组IL-8,GRO-αmRNA的表达程度明显高于对照组,RANTES,IL-8,GRO-α蛋白表达量明显高于对照组．[结论]被RSV感染的鼻黏膜组织中成纤维细胞有     

一种快速诊断呼吸道合胞病毒感染的方法

应用引物设计原则，选择呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）基因组中高度保守的Ｆ基因作为扩增靶序列，独立设计合成了两对引物，建立了一个逆转录套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＲＳＶＲＮＡ的方法。结果：对引物进行敏感度实验，其检测敏感度为每ｍｌ１０ＴＣＩＤ５０ｓ（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）的病毒量；用副流感病毒１型、甲型流感病毒、乙型流感病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒和腺病毒２型作对照，均无预期扩增产物出现，证实了设计引物的特异性；用建立的逆转套式ＰＣＲ方法对５例急性下呼吸道感染患儿的鼻咽部分泌物标本进行检测，发现３例阳性，２例阴性；同时用病毒培养法检测，结果完全相同。提示：该方法具有快速、敏感、特异和观察结果客观等优点。     

龙胆水提液体外抑制呼吸道合胞病毒作用研究

目的了解龙胆水提液体外抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的作用.方法采用细胞病变抑制实验观察龙胆水提液在HeLa细胞中对呼吸道合胞病毒的抑制作用.结果龙胆水提液的半数中毒浓度(TC50)为15.25mg/ml;抑制RSV的半数有效浓度(EC50)为1.07mg/ml,治疗指数(TI)为14.25;且对RSV的抑制作用存在明显的量效反应关系(P<0.01).结论龙胆水提液在HeLa细胞中对呼吸道合胞病毒有明显的抑制作用.