环介导等温扩增技术检测方法的研究进展

环介导等温扩增技术是一种可用于临床诊断的快速检测方法,可用于检测病毒、细菌、寄生虫等多种病原体。经不断完善,现已在临床检测过程中发挥重要作用。可用显色试剂对反应结果实现可视化,即结果的即时显示,无需后续验证。但是,无论是荧光染料还是显色指示剂,对反应过程都会产生或多或少的影响,目前研究表明羟基萘酚蓝是最好的显色试剂。同时,人们发现电化学技术也可以应用于此,使检测反应更快,操作更加简单。生物传感器可以对多种反应产物进行同步检测,而微流控芯片技术更是方便携带,有望成为实时检测技术的理想载体。     

Rapid detection of Streptococcus pneumoniae by real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification

Background and aim of study

A significant human pathogenic bacterium, Streptococcus pneumoniae was recognized as a major cause of pneumonia, and is the subject of many humoral immunity studies. Diagnosis is generally made based on clinical suspicion along with a positive culture from a sample from virtually any place in the body. But the testing time is too long. This study is to establish a rapid diagnostic method to identification of Streptococcus pneumoniae.

Methods

Our laboratory has recently developed a new platform called real-amp, which combines loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with a portable tube scanner real-time isothermal instrument for the rapid detection of Streptococcus pneumonia. Two pairs of amplification primers required for this method were derived from a conserved DNA sequence unique to the Streptococcus pneumoniae. The amplification was carried out at 63 degree Celsius using SYBR Green for 60 minutes with the tube scanner set to collect fluorescence signals. Clinical samples of Streptococcus pneumoniae and other bacteria were used to determine the sensitivity and specificity of the primers by comparing with traditional culture method.

Results

The new set of primers consistently detected in laboratory-maintained isolates of Streptococcus pneumoniae from our hospital. The new primers also proved to be more sensitive than the published species-specific primers specifically developed for the LAMP method in detecting Streptococcus pneumoniae.

Conclusions

This study demonstrates that the Streptococcus pneumoniae LAMP primers developed here have the ability to accurately detect Streptococcus pneumoniae infections by real-time fluorescence LAMP.     

环介导等温扩增技术检测钩端螺旋体的研究

目的 利用环介导等温扩增技术,建立检测钩端螺旋体的方法。方法 选取钩体LipL32基因,设计了LAMP引物。对27株钩体、25株非钩体样本予以检测,然后进行灵敏度和模拟样本的研究。结果 扩增27株钩体结果为阳性,扩增25株非钩体结果为阴性。灵敏度为200拷贝/μL,模拟样本检测下限为200条钩体/μL(煮沸法)和20条钩体/μL(试剂盒提取法)。结论 LAMP实验操作简单,对设备要求不高,可以作为钩体的快速检测方法。     

环介导等温扩增法快速检测结核分枝杆菌的临床应用评估

目的 进行环介导等温扩增法（LAMP法）快速检测结核分枝杆菌的临床验证与应用,评估该方法在结核病临床诊断中的效能。方法 选取广东6地市专业结核病防治机构（简称“结防机构”）的肺部不同疾病及健康人员的痰标本2129份,分别采用直接涂片法、罗氏固体培养法及LAMP法检测痰标本中结核分枝杆菌;另广州、汕头两市337例结核病患者的痰标本浓缩处理后进行实时荧光定量（qPCR）及LAMP两种方法检测。 结果 2129例痰标本中,直接涂片法、罗氏固体培养法和LAMP法的阳性检出率分别为13.2%（282/2129）、21.7%（463/2129）和20.3%(432/2129);同罗氏培养法相比,LAMP法灵敏度、特异度、阳性和阴性预测值分别为89.1%(432/485)、95.5%(1570/1644)、85.4%(432/506)和96.7%(1570/1623);337例浓缩处理后的痰标本qPCR阳性率为35.0% (118/337),LAMP阳性率为35.9% (121/337);LAMP法同直接涂片法检测、罗氏固体培养法和qPCR法比较,检测结果实际一致率分别为87.9%（Kappa值＝0.612）、96.1%（Kappa值＝0.89）和91.4%（Kappa值＝0.812）。 结论 LAMP法用于痰标本中结核分枝杆菌检测,其效能同罗氏培养法及qPCR法相当,同直接涂片法相比,LAMP法能够大幅提高阳性检出率,具有很好的临床应用和推广前景。     

LAMP技术在动物病毒病原检测中的应用进展

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种具有简单、快速、特异性强和扩增效率高的核酸检测技术,目前已在食品、卫生及疾病预防控制检验等领域得到了诸多应用。本文主要介绍了LAMP技术在实验及临床过程中检测肝炎病毒、流感病毒、HIV-1、狂犬病毒、乙脑病毒、冠状病毒、登革病毒等病毒病原感染的应用进展。     

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23SrRNA基因部分序列设计1套（共4条）能够识别6个区域的特异性引物；优化扩增条件；评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法，成功地建立了环媒恒温基因扩增（LAMP）检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。     

Sensitive and rapid detection of Mycoplasma pneumoniae by loop-mediated isothermal amplification

For establishment of a method for rapid diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens, we designed and evaluated a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay, using a set of primers targeting the SDC1 repetitive element of the M. pneumoniae genome. The method showed rapid and specific amplification for all the strains of M. pneumoniae tested (Type I and II), within 1 hour at 65 degrees C. No cross-reactivity with the most common causative organisms bacterial pneumonia was observed. The detection limit was shown as 6 copies, which was equal to or higher than that of the two nested PCRs used as references. Two hundred four clinical samples, comprising sputum samples, throat swabs, etc., were tested by both LAMP and PCR, and determination of the correlations revealed complete agreement individually (24 positives). The LAMP assay, a simple procedure in a closed system, allowed rapid amplification and accurate detection consistently; therefore we considered that it could become an caeasily available diagnostic method suitable for clinical situations requiring quick and appropriate decisions for treatments and care.     

Development of loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Entamoeba histolytica

ObjectiveTo develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of Entamoeba histolytica E. histolytica, the causative agent of amebiasis.MethodsThe LAMP primer set was designed from E. histolytica hemolysin gene HLY6. Genomic DNA of E. histolytica trophozoites strain HK9 was used to optimize the LAMP mixture and conditions. Amplification of DNA in the LAMP mixture was monitored through visual inspection for turbidity of the LAMP mix as well as addition of fluorescent dye.ResultsPositive LAMP reactions turned turbid while negative ones remained clear. Upon addition of a fluorescent dye, all positive reactions turned green while the negative control remained orange under ambient light. After elecrophoresis in 1.5% agarose gels, a ladder of multiple bands of different sizes can be observed in positive samples while no bands were detected in the negative control. The sensitivity of the assay was found to be 5 parasites per reaction which corresponds to approximately 15.8 ng/μ L DNA. The specificity of the assay was verified by the absence of amplified products when DNA from other gastrointestinal parasites such as the morphologically similar but non-pathogenic species, Entamoeba dispar 39, and other diarrhea-causing organisms such as Blastocystis hominis and Escherichia coli were used.ConclusionsThe LAMP assay we have developed enables the detection of E. histolytica with rapidity and ease, therefore rendering it is suitable for laboratory and field diagnosis of amebiasis.     

LAMP法检测儿童粪便中肠道腺病毒的建立

目的通过应用环介导等温扩增(LAMP)建立一种快速、简便的可视化检测儿童肠道腺病毒核酸的方法。方法登录GenBank网站下载腺病毒40和41基因型的六邻体序列,根据该区段的保守序列设计4条LAMP引物。将反应体系加入EP管,在恒温条件(65℃)扩增60min后,再以凝胶电泳和钙黄绿素染色评价LAMP法的特异性和灵敏度,并和PCR法的结果相比较。最后,同时用LAMP和PCR法对40份可疑临床样本进行检测,应用卡方检验进行统计学分析。结果 LAMP法能准确地使腺病毒40和41型得到扩增,酶切结果也正确,显示了LAMP法较好的特异性。LAMP的灵敏度比PCR高约10倍。经过对40份临床样本的检测,LAMP与PCR均没有发生非特异扩增,LAMP法和PCR法的一致性为92.5%(P0.05)且LAMP法没有漏检阳性样本。另外,使用钙黄绿素染色的方法更好地显示了产物检测的可视性和简便性。结论该研究初步建立了快速、简便、可视化检测肠道腺病毒的LAMP技术,在基层医疗机构有一定的实用价值。     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)快速检测动物布鲁杆菌的方法.方法 使用Primer 4.0,针对布鲁杆菌外膜蛋白(OMP31)基因保守区设计4条特异引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,实现DNA的梯状等温扩增,并在此方法最适扩增条件优化的基础上,对其特异性、灵敏度进行实验,同时与普通PCR灵敏度进行比较,以及进行LAMP可视化实验.结果 本研究建立的检测方法对牛种布鲁杆菌(Brucella abortus,B.abortus)544A和104M、羊种布鲁杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)Rev-1和16M、猪种布鲁杆菌(Brucella suis,B.suis)S2和1330S、犬种布鲁杆菌(Brucellac anis,B.canis)RM6/66、绵羊附睾种布鲁杆菌(Brucela ovis,B.ovis)63/290、沙林鼠种布鲁杆菌(Brucella neotomae,B.neotomae)5K33检测阳性,而耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica,Y.enterocolitica)O∶9、大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)O157∶H7和沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimunum)47729检测阴性.LAMP法检出最低DNA浓度为8.5×10-8 mg/L,较普通PCR检测灵敏度高.检测结果既可以通过电泳判定也可以通过可视化判定.结论 本研究所建立的布鲁杆菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁杆菌的快速检测.     

反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒可视化分型检测

目的 应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)可视化检测丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型,为RT-LAMP技术应用于现场或基层医院提供初步探索经验。方法 首先,收集临床阳性样本并用荧光定量PCR分型检测,把样本基本分为1型和非1型。然后分别根据HCV 1b和2a基因型设计RT-LAMP引物并优化反应条件,通过互换模板实验验证这2套引物的特异性,并通过检测稀释的模板以验证引物的灵敏度。同时用钙黄绿素进行产物显色,使HCV分型检测可视化。最后用RT-LAMP方法检测临床样本,并计算阳性率,应用配对卡方检验比较RT-LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果 优化好的RT-LAMP体系的特异性好,对HCV 1b型的检测灵敏度为10³ IU/mL,2a型的检测灵敏度为10⁴ IU/mL。另外,利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相当。通过对临床样本分型检测,HCV 1b型样本的RT-LAMP检测结果和荧光定量PCR差异无统计学意义(P>0.05),HCV 2a型样本的RT-LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P<0.05),但是未检出的样本中有2例为HCV 2b型。结论 RT-LAMP对HCV的可视化分型检测具有较好的特异性和灵敏度,操作简便,具有在现场或基层医院的应用前景。     

环介导等温扩增技术检测细粒棘球绦虫DNA的初步研究

目的评价环介导等温扩增技术（LAMP）检测细粒棘球绦虫的敏感性。方法提取细粒棘球绦虫虫卵及成虫DNA,根据棘球绦虫线粒体12SrRNA基因序列及LAMP法原理,设计4条细粒棘球绦虫特异性引物,进行LAMP反应,反应产物经SYBRGreenⅠ显色及1.5%琼脂糖电泳鉴定,同时设置泡状带绦虫及空白对照。用1000、100、10、1个虫卵/200μl细粒棘球绦虫虫卵DNA进行LAMP反应,评价其敏感性。结果细粒棘球绦虫检测管反应液呈混浊沉淀,显色后为绿色;对照组澄清,显色后为棕色。虫卵产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增产物。LAMP可检测到的虫卵最低数量为1个。结论 LAMP法敏感、特异、简便,可用于棘球蚴病病原检测和疾病监测。     

基于微流控核酸等温扩增的登革病毒现场快速检测技术研究

[摘要]?目的?结合环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和微流控芯片技术,建立一种适合现场快速检测登革病毒的方法。方法?利用RT-LAMP,针对登革病毒基因组中3’非编码区中特异性序列进行扩增,建立基于微流控芯片技术的LAMP检测方法,优化检测体系,并对该方法的灵敏性和特异性进行评估。结果?基于LAMP 和微流控芯片技术的登革病毒检测方法,通过对病毒模板进行扩增,发现与其他病毒无交叉反应,特异性良好;同时,结果显示该方法对登革病毒检测灵敏性可达61.2 pg/μl,与实时荧光定量PCR仪所达到的检测灵敏性一致。结论?基于LAMP和微流控芯片技术的登革病毒检测方法具有操作简单、快速、对设备要求低等优势,并且灵敏性、特异性均较好,是一种便于开展现场快速检测的方法。     

环介导等温扩增技术在检测细菌性肺炎常见致病菌中的应用

目的 应用环介导等温扩增(LAMP)方法对肺炎患者痰液常见致病菌进行核酸检测,研究LAMP方法在细菌性肺炎病原学诊断中的价值.方法 抽提75例肺炎患者痰液细菌DNA,根据肺炎常见8种致病细菌设计引物,应用LAMP技术扩增DNA,实时检测样本荧光信号,对定量结果应用不同界值进行定性分析,并分别与痰培养结果进行比较.结果 ...     

环介导等温扩增技术及其在寄生虫学研究中的应用

环介导等温扩增(LAMP)技术是利用2对特殊设计的引物,一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效地扩增DNA的新技术,扩增产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物,电泳图谱呈阶梯式带状分布,反应伴有白色的副产物焦磷酸镁沉淀产生,可通过肉眼定性判断反应结果。作为一种新的核酸扩增技术,已被应用于疟疾、血吸虫等寄生虫的研究中。LAMP方法敏感、特异,简便,在寄生虫学研究中有广阔的应用前景。     

环介导等温扩增技术检测蓝氏贾第鞭毛虫

目的 建立应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测蓝氏贾第鞭毛虫的方法. 方法 体外培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体,提取DNA.根据GenBank显示的贾第虫序列及环介导等温扩增技术的原理,设计4条贾第虫特异引物,利用LAMP检测蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA为对照,并将不含病原体DNA的纯水作为阴性对照.LAMP产物经SYBR green I显色后观察结果,绿色为阳性,棕色为阴性;对LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察其特征条带的情况. 结果 蓝氏贾第鞭毛虫DNA检测管经显色后呈绿色,隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA及水阴性对照管呈棕色.含有蓝氏贾第鞭毛虫DNA的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,安氏隐孢子虫DNA、恶性疟原虫DNA及阴性对照水无扩增产物. 结论 成功建立了检测蓝氏贾第鞭毛虫的LAMP方法.     

环介导等温扩增技术检测蓝氏贾第鞭毛虫

目的 建立应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测蓝氏贾第鞭毛虫的方法. 方法 体外培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体,提取DNA.根据GenBank显示的贾第虫序列及环介导等温扩增技术的原理,设计4条贾第虫特异引物,利用LAMP检测蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA为对照,并将不含病原体DNA的纯水作为阴性对照.LAMP产物经SYBR green I显色后观察结果,绿色为阳性,棕色为阴性;对LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察其特征条带的情况. 结果 蓝氏贾第鞭毛虫DNA检测管经显色后呈绿色,隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA及水阴性对照管呈棕色.含有蓝氏贾第鞭毛虫DNA的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,安氏隐孢子虫DNA、恶性疟原虫DNA及阴性对照水无扩增产物. 结论 成功建立了检测蓝氏贾第鞭毛虫的LAMP方法.     

创伤弧菌PMA RTi-PCR检测技术的建立

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(RTi-PCR)技术相结合,建立以一种快速准确的创伤弧菌检测方法。方法以vvh基因作为检测创伤弧菌的靶基因,用PMA对样品基因组提取进行前处理,抑制该DNA分子的RTi-PCR扩增。结果终浓度为3.0mg/L的PMA可有效抑制死细胞(1×108 CFU/mL)DNA的扩增;当PMA浓度小于或等于5.0mg/L时,对创伤弧菌DNA的扩增没有显著的影响;含有不同比例死活细菌的创伤弧菌混合液RTi-PCR结果表明,PMA RTi-PCR能选择性定量创伤弧菌中的活菌。纯培养创伤弧菌活细胞的检测灵敏度检测极限为2.5×101 CFU/mL,并且Ct值与细胞数的对数呈良好的线性关系,相关系数R2值为0.9982。结论 PMA RTi-PCR是一种快速灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。     

环介导等温扩增技术检测蓝氏贾第鞭毛虫

目的 建立应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测蓝氏贾第鞭毛虫的方法. 方法 体外培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体,提取DNA.根据GenBank显示的贾第虫序列及环介导等温扩增技术的原理,设计4条贾第虫特异引物,利用LAMP检测蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA为对照,并将不含病原体DNA的纯水作为阴性对照.LAMP产物经SYBR green I显色后观察结果,绿色为阳性,棕色为阴性;对LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察其特征条带的情况. 结果 蓝氏贾第鞭毛虫DNA检测管经显色后呈绿色,隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA及水阴性对照管呈棕色.含有蓝氏贾第鞭毛虫DNA的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,安氏隐孢子虫DNA、恶性疟原虫DNA及阴性对照水无扩增产物. 结论 成功建立了检测蓝氏贾第鞭毛虫的LAMP方法.