分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展

近年对结核杆菌耐药机制的研究表明，rpoB基因是利福平耐药相关基因，耐药株通常发生特定位点基因突变．因此可以通过鉴定突变有无而评估其利福平耐药性，本文对这方面研究做一简要综述。     

结核杆菌利福平耐药水平与rPOB基因突变率的关系

目的：调查临床分离结核菌株剂福平耐药水平与rPOB基因突变率的关系。方法：以结核分杆菌标准株H37RV为对照，采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）方法对100株利福平高耐药菌、16株利福平低耐药菌和20株利福平敏感菌进行了分析。结果：利福平高耐药、低耐药和敏感结核菌株rPOB基因发生点突变的比率分别为96%、31%和0%。结论：结核分支杆菌对利福平高度耐药主要因rPOB基因发生突变所致；而对利福平低度耐药的大部分结核菌株其rPOB基因未检测到点突变，可能与适应性耐药有关。     

利福平耐药性结核杆菌的直接、自动检测

结核杆菌多耐药性菌株的出现已经对公共健康构成威胁。利福平是结核病治疗体系中的一个重要组分，且多耐药结核菌株中出现最多的是利福平耐药，故利福平耐药的直接检测将成为确认多重耐药性结核病的一个有效工具。关于利福平耐药结核杆菌检测的一种快速筛选方法最近已经确立，利福平耐药的基因（rpoB）位点已被确认，这个检查方法包括利福平耐药区域的PCR（多聚酶链反应）扩增及对扩增产物进行SSCP（DNA单性多态构象分析）确认突变。     

结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法的建立

目的建立结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药基因突变的快速检测方法。方法根据结核分枝杆菌标准株H37Rv序列，自行设计覆盖rpoB、katG、inhA基因突变区的系列寡核苷酸探针，并检测临床样品中结核分枝杆菌的基因突变情况，以此来判断耐药结果。结果在56个利福平耐药菌株中，有50个菌株都在rpoB基因上榆出有突变，利福平耐药突变检出率为89．3％（50／56）；有30个利福平敏感菌株rpoB基因上都未检出突变。有58个异烟肼培养的耐药菌株中有47个在katG或inhA基因上检出有突变，异烟肼耐药突变检出率为81．0％（47／58）；有30个异烟肼敏感菌株katG或inhA基因上未检出突变。结论用膜芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核分枝杆菌耐药性的检测。     

利福平耐药性结核杆菌的直接,自动检测

结上菌多耐药性菌的出现已经对公共健康构成威胁。利福平是结构病治疗体系是一个重要组分，且多耐药结构菌中出现最多的是利福平耐经，帮利福平耐药的直接检测将成为确认多重耐药性结核病的一个有效工具。关节利福一耐经结核杆菌检测的一种快速筛选方法最近已经确立，利福平耐药的基因位点已确认，这个检查方法包括利福平耐药区域的ＰＣＲ（多聚酶链反应）扩增及对扩增产物进行了ＳＳＣＰ（ＤＮＡ单链多态构象分析）确认突变。     

焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

艾滋病合并结核病患者结核分枝杆菌耐药基因突变特征分析

目的了解云南省艾滋病合并结核病患者中结核分枝杆菌(MTB)耐利福平RNA聚合酶β亚单位编码基因(rpoB)和耐异烟肼过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(katG)、烯酰基还原酶编码基因(inhA)突变特点。方法采用基因芯片技术,对该省208例艾滋病合并结核病患者标本进行MTB利福平耐药相关基因rpoB和异烟肼耐药相关基因katG、inhA分析。结果 208例标本中共34例(16.3%)耐药,其中单耐利福平6例(2.9%),单耐异烟肼10例(4.8%),二者同时耐药18例(8.7%)。24例利福平耐药MTB的rpoB基因突变位点主要为531(TCG→TTG),占66.7%(16/24);28例异烟肼耐药MTB的基因突变位点主要为katG基因315(AGC→ACC),占78.6%(22/28)。结论云南省艾滋病合并结核病患者中MTB利福平和异烟肼耐药基因突变具有多态性,其中耐利福平rpoB基因的主要突变位点为531(TCG→TTG),耐异烟肼katG、inhA基因的主要突变位点为katG基因315(AGC→ACC)。     

耐利福平结核分枝杆菌 rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ突变的研究

目的：了解结核分枝杆菌rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ突变特征及其与利福平耐药的关系。方法对140株临床分离结核分枝杆菌进行利福平敏感性试验,并对耐利福平株分别进行rpoB耐药决定区及rpoA、rpoB、rpoC及rpoZ全基因测序。结果140株结核分枝杆菌中57株对利福平耐药。57株耐利福平结核分枝杆菌中,52株（91.2%）存在突变,其中50株为rpoB基因突变,2株为rpoC突变。在rpoB 765、1001、1156位及rpoC 51位发现新的突变位点。结论结核分枝杆菌对利福平耐药主要与rpoB和rpoC基因突变有关。     

台州地区结核分枝杆菌分离及耐药特征分析

目的了解台州地区结核分枝杆菌(MTB)和非结核分枝杆菌(NTM)的分离情况及MTB对利福平、异烟肼耐药基因突变位点分布特征,为结核病的诊断和临床用药提供参考。方法采用DNA微阵列芯片法对3 334份临床样本进行分枝杆菌菌种鉴定,并检测384株MTB对利福平、异烟肼的耐药基因。结果3 334份临床样本中MTB阳性837例(25.10%),NTM阳性265例(7.95%),居前3位的依次是胞内分枝杆菌(4.44%)、浅黄分枝杆菌(1.32%)和鸟分枝杆菌(0.75%)。不同性别和年龄患者MTB感染率不同(P0.05)。384株MTB中,对利福平耐药32株(8.33%),对异烟肼耐药27株(7.03%),双重耐药57株(14.84%)。利福平耐药基因突变位点主要是rpoB基因531位点(53.93%)和526位点(26.97%),异烟肼耐药基因突变位点主要是katG基因315位点(91.67%)。结论台州地区MTB感染较普遍,NTM感染也不容忽视。应根据MTB耐药基因检测结果合理用药。     

首次复治肺结核病结核分枝杆菌对利福平耐药性与rpoB基因RRDR突变的研究

目的：研究分离自首次复治肺结核病患者的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）临床菌株对利福平的耐药性, 及其与rpoB基因利福霉素耐药决定区（rifampicin resistance determining regions, RRDR）位点突变间的相关性。方法：收集2013年2月至2013年12月国内19家医院的首次复治肺结核患者的Mtb, 进行利福平药敏检测;使用PCR技术检测Mtb的rpoB基因RRDR位点突变。结果：来自全国12个省19家医院共141例患者的141株临床菌株获得药敏结果, 而RRDR位点测序分析显示首次复治结核患者中有53%（75/141）对利福平耐药。RRDR DNA测序共检测到72株Mtb存在rpoB耐药突变区突变, 其中71株的突变发生在RRDR, 主要突变位点分别为531位（42株）、526位（11株）和516位（10株）。有75株Mtb对利福平耐药, 其中70株（93.3%）检测到rpoB突变, 69株的突变发生在RRDR;除了2株L511P、H526N突变的Mtb对利福平敏感, 70株rpoB突变株均对利福平耐药。对于复治结核患者, 检测RRDR突变判断利福平耐药有较高的特异度。结论：首次复治肺结核病患者对利福平耐药率较高, Mtb耐利福平与rpoB基因RRDR突变密切相关, RRDR突变检测可以用于快速鉴定复治肺结核病患者的Mtb利福平耐药。     

结核分枝杆菌耐利福平基因变异株的体外最小抑菌浓度研究

目的：研究结核分枝杆菌（MTB）耐利福平临床分离株基因突变对其体外最小抑菌浓度（MIC）测定结果的影响。方法用基因芯片对临床分离的对利福平耐药的175株 MTB及对利福平敏感的48株 MTB进行耐药基因检测;并对所有标本进行利福平的 MIC测定,比较不同变异株的 MIC测定结果。结果对利福平耐药的 MTB 临床分离株基因突变以531、526、516、533位点单突变为主;531位点单突变的利福平耐药变异株 MIC 高于526位点单突变的耐药变异株,差异有统计学意义（t′＝2．2237,t′α＝2．0449,P＜0．05）;526位点单突变的利福平耐药变异株 MIC高于516位点单突变的耐药变异株,差异有统计学意义（t＝2．2056,P＝0．0329,P＜0．05）。双突变者均有较高的 MIC测定值。结论合理的基因芯片设计能检出95．0％以上的对利福平耐药 MTB变异株;对利福平耐药的 MTB变异株有不同的基因突变模式,且不同突变模式的 MTB耐药程度不同,可以为临床用药提供参考。     

基因芯片技术检测结核杆菌耐药的临床研究

目的 评价基因芯片技术在结核病防治工作中对结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药性的检测效果.方法 利用基因芯片技术对38例涂阳肺结核患者的痰标本进行异烟肼和利福平耐药检测,以传统罗氏药敏试验为金标准,对基因芯片技术的检测效果进行评价.结果 在38例菌株中,用基因芯片法进行异烟肼耐药基因检测,与罗氏药敏的符合率为84.2％,对38例进行利福平耐药基因检测,符合率为89.5％.结论 基因芯片检测异烟肼和利福平的耐药性与罗氏药敏方法具有很好的一致性,具有简便快速,灵敏度高,特异性好的优点,对临床及时准确进行抗结核治疗具有重要意义.     

GeneXpert MTB技术在肺外结核诊断中的应用进展

<正>GeneXpert结核分枝杆菌(MTB)技术是由美国Cepheid公司研发的一套半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术。以利福平耐药基因rpoB基因为靶向基因,可在2h内同时检测MTB和对利福平是否耐药~([1]),该方法于2010年由WHO推荐用于肺结核的诊断~([2]),2013年WHO又推荐其用于肺外结核的诊     

糖尿病与肺结核共病结核分枝杆菌耐药情况分析

目的 探讨糖尿病与肺结核共病(DM-TB)结核分枝杆菌耐药情况。方法 以回顾性病例对照研究方法连续收集广州市胸科医院2018年1月至2020年12月住院和门诊确诊的DM-TB患者1 948例，其中筛查出具备结核分枝杆菌培养阳性及药敏结果的病例1 012例，排除病历资料不完整病例，共获得资料完整病例438例，记录年龄、性别、血红蛋白、白蛋白、糖化血红蛋白(HbA1c)、病灶范围、空洞数量、治疗史、痰菌负荷量、利福平耐药。采用描述法和χ²检验进行组间比较分析1 012例MD-TB患者对一、二线抗结核药耐药情况。按利福平是否耐药分为利福平耐药(RR-TB)组86例，并从其余利福平敏感的352例中按随机数字表法随机选择86例作为利福平敏感(RS-TB)组。采用t检验、秩和检验或χ²检验进行组间比较分析，将纳入病例的临床特征作为自变量，利福平是否耐药作为因变量，进行多因素logistic回归分析DM-TB患者利福平耐药发生的相关危险因素。结果 1 012例TB-DM患者利福平耐药率为13.3%，其中初治利福平耐药率6.8%，复治利福平耐药率45.9%，...     

基因芯片法用于检测长沙地区结核分枝杆菌耐药性研究

目的了解长沙市中心医院2013年1月1日至2014年9月30日临床分离的1 031株结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性。方法将结核分枝杆菌培养阳性,并经鉴定为结核分枝杆菌的1 031株菌株,采用绝对浓度法进行常规药敏检测,同时应用基因芯片技术检测利福平和异烟肼耐药相关的rpoB、katG和inhA基因上的位点突变,并对2种结果进行比较。结果基因芯片法检测利福平耐药性中,其敏感株896株,耐药株135株;检测异烟肼耐药性为敏感株901株,耐药株130株。与绝对浓度法比较,基因芯片检测利福平耐药结果与其一致的菌株共1 011株(包含敏感株894株,耐药株117株),符合率为98.00%;基因芯片检测异烟肼耐药结果与其一致的菌株共1 005株(包含敏感株890株,耐药株115株),符合率为97.48%。与利福平耐药相关的rpoB基因的突变位点最常见的为531TCG→TTG突变,占耐药株的51.11%;其次为526CAC→TAC突变耐药株的10.37%;526CAC→GAC共11株菌株突变,占耐药菌株的8.15%。异烟肼耐药主要是由katG315AGC→ACC位突变引起,占耐药株的83.85%,inhA-15C→T突变仅占12.30%。结论基因芯片法与绝对浓度法结果高度一致,可成为筛查利福平和异烟肼耐药性的快速有效方法,长沙地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药以rpoB531,526及katG315突变位点为主。     

结核分枝杆菌利福平耐药基因的检测

以药物敏感试验为标准，应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析方法对６８例利福平耐药菌株和２０例利福平敏感菌株进行测定，结果８８例结核分枝杆菌均扩增出目标ＤＮＡ条带，１０例非结核分枝杆菌和８例非分枝杆菌未出现目标ＤＮＡ条带，所用引物扩增ｒｐｏＢ基因２１５ｂｐ片段为结核分枝杆菌复合群异性的。     

98例肺结核对利福平耐药的临床分析

耐药是肺结核化疗失败的主要原因之一，利福平做为细胞内外的强大杀菌药物，在结核的治疗中起着举足轻重的作用，但由于利福平的单一用药或不规律用药，使结核菌对利福平的耐药性有逐渐增加的趋势。现将我院1990—2004年98例肺结核对利福平耐药进行如下临床分析。     

RIFO杂交和限制性片段长度多态性检测耐利福平和异烟肼的结核分枝杆菌

目的评价利福平寡核苷酸探针杂交技术（RIFO杂交）和PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）在结核分枝杆菌（MTB）耐利福平（RIF）和异烟肼（INH）快速检测中的应用价值。方法选取121株北京地区MTB菌株，分别采用RIFO杂交技术和PCR—RFLP检测RIF耐药相关基因rpoB核心区和INH耐药相关基因katG315位点突变，并对所有菌株的rpoB基因核心区进行测序验证。结果RIFO杂交检测发现，91，5％（65／71）的RIF耐药株和92．9％（52／56）的耐多药菌株（至少对RIF和INH耐药）存在rpoB基因核心区突变，而RIF敏感株中未发现突变；RIFO杂交与测序结果完全一致，测序结果中有突变的位点在RIFO杂交中均有相应的野生型杂交信号缺失；PCR-RFLP结果显示，INH耐药株中katG315突变率为60.6％（40／66）。结论rpoB基因核心区可作为RIF耐药检测的分子标志及耐多药的筛选指标；RIFO杂交技术是检测MTB耐RIF的快速、准确的实验方法，具有推广及潜在的临床应用价值；PCR—RFLP可检测出大部分INH耐药株，可作为临床INH耐药性检测的辅助手段。     

98例肺结核对利福平耐药的临床分析

耐药是肺结核化疗失败的主要原因之一，利福平做为细胞内外的强大杀菌药物，在结核的治疗中起着举足轻重的作用。但由于利福平的单一用药或不规律用药，使结核菌对利福平的耐药性有逐渐增加的趋势。现将我院1990-2004年98例肺结核对利福平耐药进行如下临床分析。     

肺结核与结核性脑膜炎病例中结核分枝杆菌耐利福平相关基因突变分布分析

目的分析结核性脑膜炎与肺结核病例中,导致结核分枝杆菌利福平耐药的rpoB基因突变分布规律及差异。方法对包含利福平耐药决定区81bp的102株结核分枝杆菌临床分离株的PCR产物进行测序分析。结果 102株利福平耐药的结核分枝杆菌的rpoB基因测序发现,63株导致肺结核的结核分枝杆菌的rpoB基因突变常见位点为:531(53.97%),526(20.63%),516(6.45%)。39株导致结核性脑脑膜炎的rpoB基因突变最常见位点为:531(61.54%),526(20.51%),533(7.69%)。结论导致结核性脑膜炎与导致肺结核的结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的最常见两个突变位点(531和526)无显著差异。其中531位密码子的Ser-Leu突变率占明显优势。