新城疫病毒HN基因真核细胞定位表达的重组质粒的构建

目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

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目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

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目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

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目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

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目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

新城疫病毒HN基因真核细胞定位表达的重组质粒的构建

目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

新城疫病毒HN糖蛋白促细胞融合区域内保守氨基酸基因突变分析

目的 确定新城疫病毒(NDV)血凝素神经氨酸酶(HN)糖蛋白促细胞融合区域内的保守氨基酸功能,探讨HN糖蛋白的促细胞融合机制.方法 采用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法将HN糖蛋白促细胞融合区域内6个保守氨基酸突变为丙氨酸(A),在BHK21细胞内表达后,流式细胞仪定量分析蛋白的表达效率,并分别检测其促细胞融合活性、血细胞吸附能力(也称为受体识别活性)和神经氨酸酶活性.结果 L74A蛋白表达效率降低为72.7％,各突变株蛋白表达效率与野毒株相比差别无统计学意义(P＜0.05).各突变株蛋白促细胞融合活性都有不同程度的下降,其中I103A下降幅度最大,为野毒株的9.1％,各突变株蛋白血细胞吸附能力也都出现不同程度的降低,其中I1iA的下降最明显,为28.2％,各突变株蛋白的神经氨酸酶活性变化程度不同,其中174A略有升高,为118.6％,L110A下降幅度最大,为5.2％,I103A仅次于L1 10A,为5.7％.结论 新城疫病毒HN糖蛋白促细胞融合区域内的保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,第103位异亮氨酸(Ⅰ)是此区域内的关键氨基酸.     

Monoclonal antibodies identify a strain-specific epitope on the HN glycoprotein of Newcastle disease virus strain Australia-Victoria

A panel of monoclonal antibodies raised against the hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein (HN) of the Australia-Victoria strain of Newcastle disease virus has been used to compare that strain and eight other strains of the virus. The ability of the antibodies to neutralize infectivity, inhibit hemagglutination and neuraminidase, and bind to purified virions in solid-phase radioimmunoassays was determined for each strain. Of the four antigenic sites delineated by these antibodies on the HN of the homologous strain, site 1 (that with the greatest neutralizing susceptibility), is apparently conserved in all the strains tested as revealed by neutralization assays. The least neutralizing site, number 4, is also conserved in most of the strains tested. Site 2, which lies at or near the neuraminidase site, appears to be conserved in the avirulent strains but not in the virulent strains. An antibody to site 3 is unable to bind to a significant extent to any of the heterologous strains tested, and thus recognizes a strain-specific epitope. Inhibition of hemagglutination and neuraminidase by antibodies to each site were also examined and the results suggest that antibodies to sites 1 and 2 may distinguish virulent and avirulent strains at least with respect to these functions.