抑制消减杂交技术与基因克隆

抑制消减杂交是最近提出的以消减杂交为基础结合抑制 PCR方法发展起来的分离克隆新基因的一种新策略。该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点。本文介绍其工作原理、方法以及在肿瘤基因克隆、发育生物学、免疫调控及原核生物基因组分析等方面的应用 ,最后对方法的优缺点和应用前景作了分析     

抑制消减杂交技术研究进展

抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)是最近提出的以消减杂交为基础结合抑制PCR方法发展起来的分离克隆新基因的一种策略.该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点.本文介绍其工作原理、方法以及在肿瘤基因克隆、发育生物学、免疫调控及原核生物基因组分析等方面的应用进展,最后对方法的优缺点和应用前景作了分析.     

抑制消减杂交技术的原理及应用

基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动,对这些差异表达基因进行分离、克隆有助于了解人体各项生命活动的分子调控机制。抑制消减杂交技术是新建立的一个快速克隆差异表达基因cDNA的有效方法。本文将详细介绍该技术的原理及应用。     

抑制消减杂交技术与基因克隆

抑制消减杂交是最近提出的以消减杂交为基础结合抑制PCR方法发展起来的分离克隆新基因的一种新策略。该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点。本介绍其工作原理、方法以及在肿瘤基因克隆、发育生物学、免疫调控及原核生物基因组分析等方面的应用,最后对方法的优缺点和应用前景作了分析。     

应用基因组消减杂交分离缺失基因

应用基因组消减杂交分离缺失基因侯萍，王志华，王秀琴，吴旻分离恶性肿瘤中特异缺失基因和重排基因是当前肿瘤研究中一大热点。常用的定位克隆（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ）策略在人力、物力和时间上要求均高，不是普通实验室所能承担的。近几年来发展起来的基...     

不同种属钩端螺旋体疏水外膜蛋白的特征研究

研究钩端螺旋体外膜蛋白的结构和抗原特征，对不同种属钩端螺旋体疏水外膜蛋白进行了比较研究。方法 用Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１１４抽提１０株同种属钩体疏水外膜蛋白用不连续缓冲系统制备５％浓缩胶和１２％的分离胶，行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，在恒压下１８０Ｖ电泳５小时，考巴斯亮兰Ｇ－２５０染色。     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

利用抑制消减杂交技术(SSH)研究与Ty21a免疫相关的基因

目的:利用抑制消减杂交技术（SSH）筛选与Ty21a免疫相关的新基因。方法:以Ty21a免疫小鼠的肠细胞为tester,以正常小鼠的肠细胞为diver,提取mRNA,反转录构建cDNA文库,利用SSH技术筛选Ty21a免疫相关的新基因。结果:通过SSH技术和cDNA微矩阵技术,发现了7条与GenBank中已公布的表达序列标签（expressed　sequence tag,EST）片段没有明显同源性,可能为Ty21a免疫相关的新基因。其中3条正在用RACE-PCR法进行获得全长cDNA的工作。结论:SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法,基因表达谱芯片技术是高通量进行基因表达模式研究的方法,Ty21a可诱导多种免疫相关新基因的表达。     

利用抑制性减数杂交技术(SSH)研究IL-10抑制表达的新基因

目的　利用抑制性减数杂交 (SSH)技术筛选IL 10抑制表达的新基因。方法　以PHA刺激的U937细胞为tester,以PHA刺激同时IL 10抑制的U937细胞为driver,提取mRNA ,反转录构建cDNA文库 ,利用SSH技术筛选IL 10抑制表达的新基因。结果　通过SSH技术 ,发现了 15个可能的IL 10抑制表达的基因 ,其中 6个与GenBank中已公布的表达序列检签 (expressedsequencetag ,EST)片段没有明显同源性 ,为新基因 ,其中之一经EST拼接 ,得到全长cDNA ,为一种新的C C家族趋化因子 ,已被GenBank收录 ,收录号码为AF0 96 985。挑选 4个新基因进行Northernblot分析 ,发现IL 10可抑制其中 3个新基因表达。结论　SSH技术是一种高效的差异基因筛选方法 ,IL 10可抑制多种包括新细胞因子基因的表达     

赖型钩端螺旋体及澳洲型钩端螺旋体的ompL1和flaB2抗原基因序列分析

目的：构建棘型钩端螺旋体017及澳洲型钩端螺旋体607株外膜蛋白抗原基因ompL1和内鞭毛抗原基因flaB2的重组质粒，并分别对ompL1及flaB2基因进行序列分析。方法：通过聚合酶链反应扩增ompL1及flaB2，并将其分别克隆到pcDNA3.1/Myc-His(＋）载体T7启动子下游，构建抗原基因表达质粒，进行序列测定分析。结果：序列分析显示赖型钩体017株与澳洲型钩体607株的ompL1相同碱基949个（98．85％），碱基变异11个（1．15％）；flaB2的相同碱基823个（96．94％），碱基变异26个（3．06％），呈很高的保守性。结论：赖型钩体017株与澳洲型钩体607株的ompL1及flaB2分别具有高度同源性。     

应用抑制性消减杂交技术筛选结核分枝杆菌差异基因

目的 筛选新疆地区结核分枝杆菌临床分离株与国际标准株H37Rv之间的差异基因,初步分析这些基因的功能.方法 利用抑制性消减杂交技术,通过两轮两相杂交,驱赶相同基因富集差异基因.结果 正相抑制性消减杂交一共获得6条新疆地区临床分离株中存在的差异基因,虽然这些基因在H37Rv基因组中不存在,但与国际标准临床株CDC1551以及复合群国际标准株KMS中的对应基因高度同源,分别与编码多萜醇磷酸甘露糖基转移酶Ⅱ、单加氧酶黄素结合蛋白、酰基转移酶蛋白、染色体复制起始密码子、脂酰基载体蛋白以及5'-磷酸吡哆胺氧化酶的基因有关.结论 新疆地区结核分枝杆菌临床分离株与国际标准株H37Rv之间存在差异基因,这些差异基因的功能可能与已知同源基因的功能相似:增强细菌胞壁蛋白的吸附能力、抵抗氮氧合酶消化、提高乙酰基辅酶A的合成能力、调控复制起始密码子、合成胞壁脂酰基载脂蛋白和促进5'-磷酸吡哆胺氧化酶代谢.     

抑制性底物杂交(SSH)技术研究BXSB小鼠的差异表达基因

目的：利用抑制性底物杂交技术（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ），以ＢＸＳＢ狼疮小鼠为模型，研究系统性红斑狼（ＳＬＥ）发病相关基因。方法：分离ＢＸＳＢ和Ｃ５７－ＢＬ－６小鼠骨髓细胞，ｍＲＮＡ，反转录构建ｃＤＮＡ文库，利用技术研究ＢＸＳＢ小鼠差异表达基因。结果：获得了１２个阳性克隆，其中有３个克隆编码ＴＣＲ、ＭＨＣⅡ类分子及逆转录病毒基因表达产物，均     

大鼠压力负荷型心肌肥厚相关基因片段分离和鉴定

本实验基于心甩肥厚过程中基因表达所发生的变化,采用ＣＤＮＡ差减杂交法分离其中存在表达差异的基因片段,在三个不同时期的六组材料中共分离出三十六修养异性基因片段,其中以心肌组织作为材料分离出二十四个片段,以灌流分离的心肌细胞作为材料的十二个片段。杂交结果显示它们在心肌肥厚组和对照组中确定存在表达差异 。     

应用抑制性消减杂交技术分析淋球菌染色体介导的耐药相关核苷酸序列

目的 克隆耐药性淋病奈瑟球菌菌株与标准参考菌株之间的差异核苷酸序列。方法 应用抑制性消减杂交技术构建耐药性淋球菌与标准参考菌株差异DNA消减文库。结果 成功地构建了高特异性的淋球菌耐药菌株DNA消减文库。经对消减文库初步筛选，对其中5个克隆插入的DNA片段进行测序，经GenBank和淋球菌基因组序列库检索分析，证明5个片段均为未知新序列。结论 淋球菌耐药性相关核苷酸序列的发现将为防治淋球菌感染和研究抗淋球菌抗生素提供新的实验工具。     

应用抑制性消减杂交技术鉴定肿瘤转移抑制相关基因

目的 克隆与肿瘤转移抑制相关的基因，探讨成骨肉瘤转移的分子机理。方法 采用抑制性消减杂交技术构建了人成骨肉瘤低转移细胞株SOSP－9607的消减文库，对部分克隆进行了测序和同源性分析，用Northern杂交及后转录PCR技术证实了克隆的表达情况。结果 在低转移细胞株SOSP－9607中高表达的克隆中有2个克隆与人端粒结合因子2（telomeric repeat binding factor 2,TERF2)同源。Northern杂交及反转录PCR证实这个基因只在低转移细胞中表达，而在高转移人成骨肉瘤细胞株SOSP－M和裸鼠肺转移结节中均未表达。结论 TERF2可能在维持肿瘤细胞自身相对稳定、抑制骨肉瘤演进中起重要作用。     

抑制性消减杂交筛选不稳定性心绞痛相关基因

目的:筛选并鉴定不稳定性心绞痛淋巴细胞相关差异表达基因,探讨不稳定性心绞痛发病的分子机理。方法:应用抑制性消减杂交技术(SSH)和斑点杂交技术,筛选不稳定性心绞痛组和稳定性心绞痛组淋巴细胞差异表达基因,应用反向Northern杂交和RNA狭线杂交技术,鉴定并获得阳性序列表达标签(EST),将获得EST测序,并进行同源性比较。结果:在不稳定性心绞痛组获得3个阳性EST,在稳定性心绞痛组获得1个阳性EST,全部为已知基因的部分序列。结论:所筛选的EST与不稳定性心绞痛的患者动脉粥样硬化斑块不稳定有关。     

应用抑制削减杂交技术进行鼠疫耶尔森菌的比较基因组研究

目的确定古典型鼠疫耶尔森菌的特有序列，为建立和完善该菌基因组分型系统提供可靠数据。方法通过抑制削减杂交技术发现差异片段并应用PCR验证。结果发现了5个在不同生物型鼠疫菌问存在差异的DNA片段，其中一个383bp的片段在来自天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的30株鼠疫菌全部阳性，而来自其它鼠疫自然疫源地的菌株全部阴性，5株假结核耶尔森菌中有2株(生物Ⅰ型和Ⅱ型)阳性。结论该383bp片段为天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫菌所特有，此疫源地的菌株可能是我国较古老的鼠疫菌。