TSG101小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的：探讨TSG101基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化；DNA ladder法和流式细胞仪检测细胞转染前后对顺铂诱导的凋亡的变化；Western blotting检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax，耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞；筛选到稳定的TSG101低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT和流式细胞仪检测结果显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的生长速度显著减慢于对照组（P<0.05），且G1期的细胞比率显著高于对照组（P<0.05）；DNA ladder法和流式细胞仪检测结果显示，用10 mg/L CDDP处理36 h后，转染TSG101小干扰RNA后的细胞的凋亡数显著多于对照组（P<0.05），形成DNA条带；Western blotting显示，转染TSG101小干扰RNA后的细胞中Bcl-2和P-gp的表达明显低于对照组。结论：下调TSG101基因能抑制神经母细胞瘤细胞生长，增加细胞对化疗药物的敏感性，提示TSG101在基因治疗中具有较好的临床应用前景。     

DARPP-32基因对SH-SY5Y细胞药物敏感性的调节作用

目的：探讨DARPP-32基因对人神经母细胞瘤细胞药物敏感性的调节作用。方法：构建DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体，并将它们转导入人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后，应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定；MTT法检测细胞转染前后药物敏感性的变化；流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素的蓄积浓度的变化；RT-PCR和Western blotting检测细胞转染前后耐药相关蛋白P-gp、MRP和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果：成功构建了DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体；筛选到稳定的DARPP-32高/低表达的神经母细胞瘤细胞模型；MTT试验和流式细胞仪检测结果显示，上调DARPP-32的表达能够显著增强神经母细胞瘤细胞对长春新碱、阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性，提高细胞内阿霉素的蓄积（P<0.05），转染DARPP-32小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低，细胞内的阿霉素蓄积量显著减少（P<0.05）；RT-PCR和Western blotting结果显示，DARPP-32能够下调 P-gp 和Bcl-2的表达。结论：DARPP-32基因能够调节神经母细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有较好的临床应用前景。     

利多卡因对SH-SY5Y细胞的损伤作用

目的: 采用SH-SY5Y细胞体外培养模型,通过观察细胞形态、测定细胞活力和细胞凋亡率,探讨不同浓度利多卡因对SH-SY5Y细胞的损伤作用。方法: SH-SY5Y细胞离体培养, 分为4组, 即: 正常培养组(对照组, 未经药物处理); 0.5%、1%、2%利多卡因组(L1、L2、L3组), 分别用相应浓度的利多卡因处理SH-SY5Y细胞10 min。在药物处理10 min后观察细胞形态, 并分别在药物处理后5 min (T1)、10 min (T2)、药物处理结束后15 min (T3)、药物处理结束后12 h (T4)测定细胞活力及细胞凋亡率。结果: 正常培养SH-SY5Y细胞胞体粗大, 呈多角形, 出现树突状突起, 神经突起, 多而粗大, 分布成网络, 各实验组SH-SY5Y细胞则变圆, 回缩, 轴突渐消失。各实验组不同浓度的利多卡因对SH-SY5Y细胞活力均有明显影响, 利多卡因处理5 min后, 各组细胞活力明显下降, 且随剂量增加, 细胞活力下降明显增加。对照组细胞凋亡率在各时点保持在5.9%~6.3%之间, 实验组细胞在利多卡因处理后各时点细胞凋亡率明显增加, 且随着浓度的增加,细胞凋亡率也增加。结论: 0.5%、1%、2%利多卡因对SH-SY5Y细胞均有损伤作用, 且随浓度的增加,损伤程度加重。     

DADLE对SH-SY5Y细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的：探讨[D-Ala2,D-Leu5] enkephalin（ DADLE）对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞的缺氧复氧的保 护作用。方法：将体外培养的SH-SY5Y 细胞分别缺氧6 、12、24 h 和48 h,均复氧4 h 后观察细胞形态改变,采用 MTT法检测细胞生存率,评估细胞损伤程度。在此基础上,于缺氧12 h 期间首先给予DADLE 100 pmol/L 作用于 细胞,评价DADLE能否减轻神经细胞缺氧复氧损伤;继而分别用10 pmol/L、100 pmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L 和100 nmol/L 不同浓度的DADLE溶液处理细胞,研究DADLE保护作用是否具有剂量效应关系。结果：SH-SY5Y 细胞缺氧6、12、24 h 或48 h,复氧4 h 后,细胞生存率分别为（68.1±4.3）％、（52.6±2.8）％、（26.7±1.5）％ 或（3.5±1.7）％。SH-SY5Y 细胞缺氧12 h 期间给予DADLE 100 pmol/L 处理可使细胞生存率上升到（58.7±0.46）%。 5 个给药浓度中,10 pmol/L 和100 pmol/L DADLE可使神经细胞生存率上升,而1、10 nmol/L 和100 nmol/L 则变 化不明显。结论：DADLE对SH-SY5Y 的缺氧复氧损伤具有保护作用,且其保护效果呈现出较小剂量优于较大剂量 的量效关系,本实验中最佳保护剂量为10 pmol/L。     

麦芽酚可抑制活性氧引起的SH-SY5Y细胞凋亡

近年来研究表明，氧化应激在阿尔茨海默病等神经退行性疾病发生发展中具有重要作用。本文研究了麦芽酚对过氧化氢(H2O2)引起的人神经瘤细胞株(SH-SY5Y)凋亡时细胞形态、磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和DNA损伤的保护作用。结果发现麦芽酚浓度为2mmol／L，作用2h后，可以保护细胞免受H2O2引起的氧化损伤。实验结果表明麦芽酚可作为一种抗氧化剂，有效保护H2O2引起的SH-SY5Y的凋亡。     

AIF靶向短发夹RNA干扰重组载体对神经母细胞瘤细胞SHSY5Y的沉默作用

目的探讨AIF基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒对神经母细胞瘤细胞(SHSY5YAIF)基因的干扰作用。方法根据siRNA设计原则,构建靶向AIF基因的短发夹RNA干扰质粒(pGPU6/GFP/AIF),使用脂质体法转染人神经母细胞瘤细胞,通过RT-PCR和Wester blot印迹检测神经母细胞瘤细胞AIF基因mRNA和蛋白表达水平。结果 pGPU6/GFP/AIF重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确。质粒成功转染SHSY5Y细胞后,该细胞的AIFmRNA和蛋白表达明显下降(P0.05)。结论成功构建靶向AIF基因的shRNA表达载体转染神经母细胞瘤细胞,有效抑制AIFmRNA和蛋白表达,为AIF基因靶向治疗提供前期的实验依据。     

肿瘤抑制剂GA对SH-SY5Y细胞凋亡的影响及分子机制研究

为了探讨HSP90特异的功能抑制剂geldanamycin(GA)能否用于神经母细胞瘤的临床治疗 ,通过检测未分化的和全反式维甲酸 (RA)诱导分化的神经母细胞瘤SH SY5Y细胞在不同浓度GA处理后的细胞存活率 ,发现GA呈剂量依赖性诱导SH SY5Y细胞凋亡 ,但是分化细胞对同样剂量的GA不是很敏感 [细胞存活率依次为 (82 0±6 0 ) %比较 (6 5 0± 3 0 ) % ,P <0 0 2 ;(6 7 9± 3 1) %比较 (4 3 4± 3 9) % ,P <0 0 3;(4 3± 0 8) %比较 (0 4±0 1) % ,P <0 0 5 ]。Western印迹分析和免疫荧光实验显示 ,GA能抑制细胞中c Jun和c Fos的表达 ,并且GA剂量越高 ,其抑制越明显 ;同时GA也诱导了p5 3的核聚集。与未分化细胞相比 ,在相同剂量GA处理后分化细胞中c Jun和c Fos的表达均比未分化细胞略高 ;但是分化细胞中p5 3的核聚集却不如前者明显。提示未分化细胞对同样剂量的GA比分化细胞更敏感 ,可能与分化细胞能抵抗GA引起的c Jun、c Fos的降低以及p5 3的核聚集有关。     

RNA干扰抑制α3神经型尼古丁受体的表达对SH-SY5Y神经细胞抗氧化能力的影响

目的 探讨通过RNA干扰技术抑制α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因表达后该受体对神经细胞抗氧化能力的影响,来了解α3 nAChR的神经保护作用.方法 设计并体外合成α3 nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸,退火后克隆至pSilencer 3.1-H1 nco质粒中,构建重组质粒α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo.将α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo转染SH-SYSY细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用即时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染细胞中α3 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化.用1 μmo1/Lβ淀粉样肽1-42(Aβ1-42)处理转染细胞后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞活力;用比色法测定其脂质过氧化产物含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性.结果 成功构建α3 nAChR siRNA表达质粒,转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α3 nAChR mRNA及蛋白表达量均降低(抑制率分别为98%和66%);经转染处理的细胞活力明显低于对照组,细胞中脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性不同程度的降低;抑制α3 nAChR基因表达后能增强Aβ的神经细胞毒性作用.结论 成功构建的α3 nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3 nAChR基因表达,α3 nAChR基因表达抑制后可引起氧化应激水平升高,并增加Aβ的神经毒性,表明α3 nAChR具有一定的抗氧化能力和神经保护作用.     

胞外高浓度ATP诱导SH-SY5Y细胞的自噬和凋亡

 目的：观察胞外高浓度ATP损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,探讨损伤中自噬和凋亡发生的规律和特点。方法：培养的SH-SY5Y细胞按照加入ATP的浓度和作用时间进行分组。CCK-8法检测细胞生存率,单丹磺酰戊二胺染色检测自噬空泡的变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞凋亡率变化,蛋白质印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ）的表达。结果：（1）与对照组相比,不同浓度（3、6、9、12、15 mmol/L）的ATP作用3 h均使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,且呈剂量依赖性;不同作用时间（1、2、3、6 h）ATP（6 mmol/L）也可使SH-SY5Y细胞存活率明显降低,3 h达高峰,呈时间依赖性。（2）ATP作用1 h时SH-SY5Y细胞自噬空泡显著增多（P<005）,随时间延长,6 h时降到对照水平;ATP作用1 h时,LC3-Ⅱ表达显著增强（P<005）,形成高峰,与自噬空泡增多的时点重合,2 h、3 h时LC3-Ⅱ表达水平逐渐减弱,6 h时降到对照水平。（3）与对照组相比,ATP作用3 h后细胞凋亡率达高峰（P<005）,6 h时仍然保持在3 h的水平;cleaved caspase-3表达量同步增强（P<005）,6 h时达高峰。结论：胞外高浓度ATP能够诱导SH-SY5Y细胞自噬和凋亡;自噬增强在前,凋亡高潮在后;随着ATP作用时间的延长,凋亡占主导地位。     

雷帕霉素减轻氧糖剥夺对SH-SY5Y细胞的损伤

目的:观察雷帕霉素(Rapa)对氧糖剥夺(OGD)的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的影响,并探讨自噬在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞随机分为4组:正常对照组(常规培养,不进行OGD处理)、Rapa组、OGD组(无糖培养基、1%O_2的三气培养箱内孵育细胞12 h)和Rapa+OGD组。进行形态学观察;MTT法检测细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)漏出率判断细胞损伤的程度;caspase-3活性检测试剂盒检测酶活性;原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡水平;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ及自噬调控蛋白beclin-1的表达。结果:与OGD组相比,Rapa+OGD组的细胞存活率明显升高(P0.05),LDH漏出率及caspase-3酶活性明显降低(P0.05)。TUNEL染色观察结果显示,与OGD组相比,Rapa+OGD组的细胞凋亡明显减少(P0.05);Western blot实验结果显示Rapa+OGD组的Bcl-2、beclin-1及LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平显著高于OGD组(P0.05),而Bax蛋白水平明显低于OGD组(P0.05)。结论:Rapa对OGD损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用,其机制可能与上调beclin-1蛋白、激活自噬有关。     

Hypoxia and reoxygenation increased BACE1 mRNA and protein levels in human neuroblastoma SH-SY5Y cells

Ischemic cerebrovascular diseases, usually involved in hypoxia and reoxygenation, have been reported to increase the risk of dementia such as Alzheimer's disease (AD). β-site amyloid protein precursor (APP)-cleaving enzymes (BACE1) have been identified to participate in the secretion of β-amyloid peptides (Aβ), and its expressive alteration would contribute to the AD neuropathology. We have investigated the effect of hypoxia (0% O₂, 24 h) and reoxygenation (0 h, 12 h and 24 h after 24 h hypoxia) on BACE1 mRNA and protein levels in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. At the same time, we also examined the effect of hypoxia and reoxygenation on APP mRNA and protein levels. We demonstrated that hypoxia and reoxygenation did not alter APP mRNA and protein level, However compared to those of controls, BACE1 mRNA levels were up-regulated by 31.5% (P = 0.028) and 35.1% (P = 0.005) at 12 h and 24 h and the protein levels increased to 22%(P = 0.021), 42% (P = 0.000) and 51.5% (P = 0.000) at 0 h, 12 h and 24 h after reoxygenation, respectively. Thus by up-regulating of BACE1 mRNA and protein level in the neuronal cell, hypoxia may be a linkage in the pathophysiology between cerebravascular diseases and AD.     

依达拉奉通过microRNA-25抑制高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

目的:探讨依达拉奉通过微小RNA-25(microRNA-25,miR-25)对高糖诱导的人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法:将SH-SY5Y细胞用含高浓度葡萄糖的DMEM培养基和依达拉奉的联合培养液共同培养24 h。MTT比色法测定SH-SY5Y细胞存活率;DCFH-DA荧光探针法检测SH-SY5Y细胞中活性氧簇(ROS)的水平;采用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡率;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平;实时定量PCR检测细胞中miR-25的表达水平。为进一步阐明依达拉奉抑制高糖诱导的神经细胞凋亡的作用靶点,我们将miR-25抑制剂应用于细胞,之后采用caspase-3凋亡试剂盒检测细胞的凋亡率。结果:与对照组相比,高糖诱导后细胞存活率明显降低,细胞中的ROS水平和细胞凋亡率明显升高,Bax的表达明显增加,Bcl-2的表达明显降低,miR-25的表达水平也明显降低。给予依达拉奉治疗之后,细胞存活率明显升高,ROS含量和细胞凋亡率明显降低,Bax的蛋白水平明显降低,Bcl-2蛋白水平明显升高,miR-25的表达水平亦明显升高。进一步给予miR-25抑制剂后,caspase-3的水平明显升高,此时同时给予依达拉奉后并不能抑制高糖引起的神经细胞的凋亡。结论:依达拉奉对高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用,其作用靶点可能是miR-25。     

Downregulation of survivin by siRNA inhibits invasion and promotes apoptosis in neuroblastoma SH-SY5Y cells

Neuroblastoma is a solid tumor that occurs mainly in children. Malignantneuroblastomas have a poor prognosis because conventional chemotherapeutic agents arenot very effective. Survivin, a member of the inhibitor of the apoptosis proteinfamily, plays a significant role in cell division, inhibition of apoptosis, andpromotion of cell proliferation and invasion. Previous studies found that survivin ishighly expressed in some malignant neuroblastomas and is correlated with poorprognosis. The aim of this study was to investigate whether survivin could serve as apotential therapeutic target of human neuroblastoma. We employed RNA interference toreduce survivin expression in the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line and analyzedthe effect of RNA interference on cell proliferation and invasion invitro and in vivo. RNA interference of survivin led to asignificant decrease in invasiveness and proliferation and increased apoptosis inSH-SY5Y cells in vitro. RNA interference of survivin inhibited tumorgrowth in vivo by 68±13% (P=0.002) and increased the number ofapoptotic cells by 9.8±1.2% (P=0.001) compared with negative small interfering RNA(siRNA) treatment controls. Moreover, RNA interference of survivin inhibited theformation of lung metastases by 92% (P=0.002) and reduced microvascular density by60% (P=0.0003). Survivin siRNA resulted in significant downregulation of survivinmRNA and protein expression both in vitro and invivo compared with negative siRNA treatment controls. RNA interference ofsurvivin was found to be a potent inhibitor of SH-SY5Y tumor growth and metastasisformation. These results support further clinical development of RNA interference ofsurvivin as a treatment of neuroblastoma and other cancer types.     

孕酮减轻ATP诱导的SH-SY5Y细胞损伤

目的:探讨孕酮对抗腺苷三磷酸(ATP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用和机制。方法:取对数生长期的SH-SY5Y细胞按照孕酮或ATP浓度的不同进行分组,CCK-8法检测细胞存活率,YO-PRO-1染色检测细胞膜通透性,Fluo-3染色检测细胞内Ca~(2+)浓度的变化,Western blot法检测嘌呤能P2X_7受体表达的变化。结果:与对照组相比,不同浓度(1、3、5和7 mmol/L)ATP作用2 h,SH-SY5Y细胞存活率显著降低(P0.05),细胞摄入YO-PRO-1的荧光强度明显增加(P0.05),且呈剂量依赖性。浓度为3、10和30 nmol/L的孕酮预孵育30 min可减轻ATP损伤作用,细胞存活率较单纯ATP组明显升高(P0.05或P0.01)。孕酮(30nmol/L)或P2X_7受体拮抗剂KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min均可显著抑制ATP诱导的胞内YO-PRO-1的荧光增强(P0.01),而孕酮和KN-62两者之间没有明显差异。正常组细胞内钙离子含量少,ATP组细胞内钙离子荧光强度较对照组明显增高(P0.05),孕酮(30 nmol/L)或KN-62(500 nmol/L)预孵育30 min可明显降低(P0.05)ATP诱导的胞内钙荧光增强,而孕酮和KN-62两者之间的作用无明显差异。ATP组SH-SY5Y细胞P2X_7受体表达较对照组明显增加(P0.05),而孕酮(30 nmol/L)预孵育30 min则可显著降低ATP诱导的P2X_7受体表达(P0.05)。结论:孕酮可抑制ATP诱导的P2X_7受体表达、膜孔形成和胞内Ca~(2+)升高,降低细胞死亡率,明显减轻高浓度ATP对SH-SY5Y细胞的损伤作用。     

Glutathione S-transferase pi regulates UV-induced JNK signaling in SH-SY5Y neuroblastoma cells

Activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway is a key event in apoptosis. The cellular mechanisms underlying the control of JNK catalytic activity before and immediately after stress in neuronal cells are still not completely understood. Under resting conditions the basal activity of JNK is low, since JNK is kept inactive by the presence of one or more endogenous repressors, including glutathione S-transferase pi (GSTpi). The aim of this study was to investigate the control of JNK signaling by GSTpi. We examined the modifications of GSTpi protein expression and oligomerization after UV irradiation-induced stress in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. In parallel, we investigated the effect of UV irradiation on JNK activation and c-Jun phosphorylation, and whether apoptosis represents a functional consequence triggered by this signaling pathway. We show that in SH-SY5Y cells JNK phosphorylation and activation precedes c-Jun phosphorylation and caspase-3 cleavage. Importantly, the increase of JNK enzymatic activity correlates with the dissociation of GSTpi–JNK complexes and the increased concentration of GSTpi multimer forms. Results presented herein show for the first time direct interaction between JNK and GSTpi in SH-SY5Y neuroblastoma cells, and suggest that in these cells GSTpi may serve as a regulator of JNK catalytic activity. This work contributes to further elucidate the mechanisms underlying the regulation of JNK activity under stress conditions.