肝豆状核变性ATP7B基因外显子突变研究

目的研究Wilson病（WD）ATP7B基因突变的特点,探讨WD基因诊断的意义和方法,并分析WD患者基因型和临床表型之间的关系。方法应用PCR产物直接DNA测序法对18例WD患者及其21例亲属的第8、12、14号外显子进行检测,分析临床袁型与ATP7B基因突变类型的关系。结果（1）3个外显子共发现7种类型突变,均为点突变,其中同义突变3种,错义突变4种;（2）Arg778Leu突变和Lys952Arg突变的患者与其无该点突变的患者比较,临床表现都未见明显差异。结论（1）产物DNA直接测序法可用于WD的早期诊断;ATP7B基因8号外显子778密码子是WD患者的高频突变位点;12号外显子952密码子可能是WD患者的高频突变位点;我们的实验未发现14号外显子基因突变;（2）Arg778Leu突变和Lys952Arg突变与临床表型在本研究中均未发现有相关性。     

肝豆状核变性患者ATP 7B基因外显子8、12、18的DNA测序突变

目的 对肝豆状核变性(WD)患者ATP7B基因外显子(exon)8、12、18进行PCR扩增测序,研究其突变特点.方法 对30例患者(WD组)和10例健康者(对照组)提取外周血基因组DNA,PCR扩增ATP7B基因外显子8、12、18相关片段,并对扩增产物进行测序和分析测序结果 .结果 对照组未见异常,WD组发现12例患者外显子8有突变,突变率为40.0%,测序发现有6例患者外显子Arg778leu呈复合杂合子突变;发现4例外显子12有突变,有2例患者存在双重突变,外显子18未检出突变.结论 WD的ATP7B基因外显子8、12为突变的热点区,18号外显子不是突变热点.     

Wilson病基因突变的检测和分析

目的:研究Wilson病(WD)基因突变的类型和发生情况,探讨WD基因诊断的意义和方法。方法:采用变性高效液相色谱(DHPLC)及单链构象多态性(SSCP)方法结合DNA序列分析对12个无亲缘家系13例患者及22位亲属进行ATP7B基因外显子5、8、12突变的检测。结果:35例DNA标本确认6种基因突变,其中包括3种错义突变(R778L,D756N,R952K),1种缺失突变(2790del3),2种同义突变(2310C→G,2850G→C)。在13例患者中,发现6例R778L突变,2例D756N突变,R952K和2790del3各1例,均为杂合型突变,涉及10个等位基因,本组检出率为38.5%(10/26)。结论:PCR-SSCP,DHPLC是WD基因突变筛查较为敏感而特异的方法,且二者各具特点。经检索2790del3是ATP7B基因新突变类型。R778L是中国人最常见的突变类型。     

遗传性高铁血红蛋白一家系的基因诊断

目的 检测Ⅰ型遗传性高铁血红蛋白血症(HM)先证者(L72P,长乐)家系成员的细胞色素b5还原酶(b5R)基因的突变。方法 PCR方法扩增正常人和HM先证者之兄、父、母的b5R基因组DNA片段(含第3和第4外显子);用限制性内切酶Apa Ⅰ分析扩增产物。结果PCR扩增产物用Apa Ⅰ酶切后,正常人为649和471 bp;先证者之兄为649、440和31bp,表明存在b5R基因第72密码子纯合子突变:其父、母均为649、471、440和31bp,表明存在b5R基因第72密码子杂合子突变。结论PCR结合Apa Ⅰ内切酶分析可用于b5R基因第72密码子突变的检测;PCR-RFLP方法是检测人群中b5R基因杂合子突变的简捷有效的方法。     

脂蛋白脂肪酶基因突变的研究

目的：筛查国人脂蛋白脂肪酶(LPL)基因的突变，并探讨其与高甘油三酯血症的关系。方法：对高甘油三酯血症组(48例)和正常甘油三酯对照组(121例)的各扩增片段进行分析，电泳图谱异常者进行PCR产物测序。对于频率较高的多态性位点，引入限制性核酸内切酶位点利用PCR-RFLP进行鉴定。结果：在高甘油三酯血症人群中，检出2例内含子3受位剪接点上游6bp的C→T转换的突变杂合子，1例外显子5Pm^207→Leu突变杂合子，在全部样品中检出1例Ser^447→stop突变纯合子，50例Ser^447→stop杂合子。结论：天津地区人群中存在着LPL基因突变，除Ser^447→stop外，内含子3和外显子5的突变多与高甘油三酯血症相关，可能是高甘油三酯血症的遗传易感因子。     

膀胱移行细胞癌组织中PTEN基因第5、8外显子的突变分析

目的：了解膀胱移行细胞癌（TCC）组织中PTEN基因第5外显子（Exon5）和第8外显子（Exon8）的突变情况及其与膀胱癌生物学行为的关系。方法：选择突变率较高的PTEN基因Exon5和Exon8，应用银染PCR—SSCP并结合基因测序方法分析46例TCC患者的PTEN突变情况。结果：PTEN的Exon5扩增产物为379bp，所有肿瘤组织均表现为3条迁移带（2条单链和1条双链），没有发现额外迁移带。Exon8扩增产物为550bp，经酶切为两个片段。所有肿瘤组织均表现为6条迁移带（4条单链和2条双链），没有发现额外迁移带。结论：TCC患者的肿瘤组织中PTEN基因Exon5和Exon8的突变不是一个常见事件，PTEN是否还存在其他灭活方式还需要进一步研究。     

颅骨锁骨发育不全家系基因多态性与表型关系的研究

目的研究家族性颅锁骨发育不全家系基因型与临床表型的关系。方法提取临床收集的一个先天性颅锁骨发育不全家系中患者和健康成员外周血基因组DNA,PCR扩增RUNX2/CBFA1基因7个编码外显子及其侧翼内含子序列,分别进行正反向测序,对发现的突变位点行酶切分析验证。结果家系中两位患者（先证者及其父亲）显示cDNA 346T→A的杂合突变,使编码的色氨酸变成精氨酸（W 116R）,属错义突变。酶切结果进一步证实了该错义突变。测序还发现先证者父亲cDNA 198G→A的杂合突变,致第66位氨基酸的密码子GCG被GCA取代,但二者均编码丙氨酸,属同义突变。先证者及家系健康成员中未见此改变。结论 RUNX2/CBFA1基因346T→A杂合突变是该家系发病的分子基础。     

一氧化氮合酶基因多态性与脑梗塞的关系

脑血管病是多基因、多因素疾病,一氧化氮合酶基因是研究的主要侯选基因。人类内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因位于第7号染色体7q35-36区,为单拷贝基因．全长约21kb,含26个外显子及25个内含子。孙晓红等报道Marsden在1993年首先发现eNOS基因外显子7上894位核苷酸存在G-T的突变位点,从而使298位编码蛋白出现谷氮酸由天冬氮酸替代（Glu→Asp）。G894T突变构成2种等位基因G和T,3种基因型GG、GT和TT。国内外研究结果也认为eNOS基因外显子7的第894位核苷酸多态性．影响了eNOS酶自身的功能活性。     

PAH基因外显子7上一个中性突变的鉴定

应用单链构型多态(Single strand conformation polymorphism,SSCP)分析技术检测了苯丙酮尿症患者的苯丙氨酸羟化酶基因外显子7,其中一例样品含突变泳带,经直接测序结果发现在密码子245上有一个碱基替换,由 G—A,但氨基酸未发生改变,为一例中性突变。     

细胞色素P450 1B1基因多态性与子宫内膜癌易感性研究

目的研究细胞色素P4501B1基因外显子2密码子119（G-T）、外显子3密码子432（C-G）多态性与子宫内膜癌遗传易感性的关系。方法采用等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）法对72例子宫内膜癌患者和80例对照者进行CYP1B1基因密码子119（G-T）、密码子432（C-G）突变分析,用SP免疫组化法进一步研究雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）的表达是否受CYP1B1基因多态性的影响。结果CYP1B1基因密码子119、432中等位基因G、T和C、G在子宫内膜癌组和对照组分布的差异有显著性（χ^2=16.817,P=0.000;χ^2=9.133,P=0.003）,其中等位基因T、G使患子宫内膜癌危险性分别增加了3.052和2.213倍。CYP1B1基因密码子119G/T各基因型分布两组间有显著性差异（χ^2=18.267,P〈0.01）,纯合突变T/T、G/G基因型、杂合突变G/T、C/G基因型与野生G/G、C/C基因型相比,患子宫内膜癌的危险度分别提高了4.258、3.871倍和3.235、2.214倍。此外,119T/T、G/T基因型、432G/G、C/G基因型者ER阳性表达率高于119G/G、432C/C野生基因型,有显著性差异（χ^2=6.750,P=0.034;χ^2=6.977,P=0.031）。结论CYP1B1基因密码子119、432突变等位基因与子宫内膜癌的发生有一定关联,突变基因型增加了子宫内膜癌的发病风险,且与ER的表达相关。     

PCR-SSCP检测肥厚型心肌病心肌肌钙蛋白Ⅰ基因7号外显子突变

目的研究聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）法检测肥厚型心肌病心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因7号外显子突变的可行性。方法肥厚型心肌病患者59例（2例曾直接测序证实7号外显子Arg145Trp突变）,PCR扩增cTnI基因7号外显子,予PCR-SSCP检测突变,与直接测序结果进行比较。结果2例Arg145Trp突变者均有异常条带,余未证实突变者未见阳性条带。结论PCR-SSCP检测肥厚型心肌病cTnI基因Arg145Trp突变具有良好的检出性,可作为大规模人群筛查的工具。     

早发性帕金森病Parkin基因突变研究

目的：研究早发性帕金森病患者Parkin基因的突变情况，并分析Parkin基因突变对其功能的影响。方法：以40例早发性帕金森病患者和100例正常人为研究对象，提取基因组DNA，扩增Parkin基因的7对外显子，并用单链构象多态性（SSCP）的方法分析Parkin基因的缺失突变和点突变情况。结果：2例患者外显子4缺失．1例患者外显子2缺失，1例患者外显子7发乍G951C突变。正常人中未发现外显子缺失和点突变。结论：Parkin基因突变是早发性帕金森病患者发病原因之一。     

塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程中的基因突变（二）

目的 观察抗癌药物塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中相关基因的突变并分析其意义。方法 以塞替派作为致癌原诱导永生化人支气管上皮细胞（BEAS－2B）,获得转化细胞（BEAS－TE）和克隆化多倍体癌前转化细胞（BEAS－STE）。采用PCR－SSCP法检测上述3种细胞p53、p16和Ki-ras 3种基因是否出现点突变,进一步测序确定其突变情况。结果 SSCP结果阳性的有BEAS－TE细胞p53第7外显子,BEAS－STE细胞p53第8外显子以及这二种细胞的p16基因第1外显子;Ki-ras基因第1外显子的结果仅为可疑阳性。测序证明,p53、Ki-ras基因存在多位点的碱基突变,而p16基因仅为单位点的碱基突变。结论 塞替哌可诱发人支气管上皮细胞p53、Ki-ras多位点的碱基突变和p16的单位点突变。分析前者为塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件,后者是次要分子事件。     

原发性高胆固醇血症家系成员载脂蛋白B-100基因突变的筛查

目的　筛查原发性高胆固醇血症患者载脂蛋白B 1 0 0基因可能存在的突变体。方法　通过改变参与巢式聚合酶链反应 (PCR)反应的一个寡核苷酸引入酶切入点法检测载脂蛋白B 1 0 0基因发生R350 0Q的突变情况。在其附近可能存在的突变位点用单链构象多态性分析 (SSCP)和DNA测序分析法进行筛查。结果　 34例样本均未发现载脂蛋白B 1 0 0基因突变位点。结论　载脂蛋白B 1 0 0基因突变可能不是引起原发性高胆固醇血症的主要原因。     

新疆反复呼吸道感染儿童甘露聚糖结合凝集素水平检测及其基因多态性分析

目的 探讨新疆反复呼吸道感染儿童(复感儿)血清甘露聚糖结合凝集素(MBL)水平与MBL第一外显子54密码子基因多态性的关系.方法 用酶联免疫分析方法检测6个月至10岁复感儿73例(复感儿组)与同龄健康儿童92例(对照组)的血清MBL水平;用聚合酶链反应(PCR) -限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)方法检测上述复感儿中73例的MBL第一外显子54密码子基因多态性以及突变频率.结果 复感儿血清MBL水平为(2.2±1.2)ng/L,健康儿童血清MBL水平为(3.3±2.1)ng/L,2组差异有统计学意义(P＜0.05).复感儿血清MBL水平明显低于健康儿童.新疆复感儿MBL-54密码子突变频率为27.4％,结果与国内报道的健康儿童突变频率1.8％相比较,明显高于国内正常儿童(P＜0.05).复感儿MBL-54密码子突变的频率在维吾尔族(9％,7/22)和汉族(18％,13/51)间的差异无统计学意义;不同性别的复感儿MBL-54密码子突变的频率差异无统计学意义.结论 新疆复感儿MBL-54密码子突变频率高于健康儿童,使得复感儿血清MBL水平较正常儿童低,造成免疫水平低下,是这些儿童表现反复呼吸道感染原因之一.     

恶性间皮瘤p53基因点突变和蛋白表达

p53基因是在人类多数肿瘤中发生高频突变的肿瘤相关性最强的抑癌基因，其突变特征为80%的点突变均集中在进化的高保区内，即对应的第5-8外显子部位. 恶性间皮瘤是一种与接触石棉有明确关系的间叶源性肿瘤. 为深入阐明p53基因在人恶性间皮瘤发生发展中的作用，应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和免疫组化技术研究了34例恶性间皮瘤p53 基因的点突变情况. 结果表明： 56%(19/34)的病例存在p53基因的点突变，突变率在不同的组织学类型之间有一定的差异；在所发现的22次突变中有16次均发生在第7外显子，表明第7外显子是本组恶性间皮瘤的突变热点所在；免疫组化染色：23%（8/34）的病例P53蛋白免疫组化染色为阳性，阳性率低于基因突变率. 以上资料提示p53基因突变可能在恶性间皮瘤的癌变机制中起着重要作用.