GDNF对视神经切断后视网膜神经节细胞生存的影响

胶质源性神经营养因子（glial cell-line derived neurolrophic faclor,GDNF）是一种在体内有广泛表达并且作用复杂的神经营养因子，离体培养时能明显刺激中枢及外周神经系统神经元的存活，活性及突起的生长。本实验应用大量视神经切断模型，采用玻璃体腔注射法研究GDNP对视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RCGs）的保护作用。     

脑源性神经营养因子与视网膜神经节细胞

脑源性神经营养因子作为神经营养因子家族中的重要成员,广泛分布于中枢神经系统。视神经与视网膜是中枢神经系统的一部分,视网膜神经节细胞在视觉通路中起着重要的传导作用。脑源性神经营养因子作为一种靶源性神经营养因子和顺行性神经营养因子,在视网膜神经节细胞的生长发育过程中起重要调控作用,同时对损伤的视网膜神经节细胞有促进其存活及轴突生长的作用。     

脑源性神经营养因子与视网膜神经节细胞

脑源性神经营养因子作为神经营养因子家族中的重要成员，广泛分布于中枢神经系统。视神经与视网膜是中枢神经系统的一部分，视网膜神经节细胞在视觉通路中起着重要的传导作用。脑源性神经营养因子作为一种靶源性神经营养因子和顺行性神经营养因子，在视网膜神经节细胞的生长发育过程中起重要调控作用，同时对损伤的视网膜神经节细胞有促进其存活及轴突生长的作用。     

神经营养因子与生长因子在体外对人视网膜神经节细胞之作用

目的 研究神经营养因子(neurotrophic factor)与生长因子(growth factor)在体外对人视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)生存的作用。 方法 从捐献的尸体眼球分离并培养RGC。RGC之鉴定系根据形态学与免疫细胞化学研究。将各种神经营养因子与生长因子分别加入培养液。对RGC计数,并与未加任何因子的对照组相比较。 结果 未加任何因子的培养中不见或仅有极少量的RGC。加有神经营养蛋白-3(neurotrophin-3,NT-3)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)与血小板源性生长因子(plate derived growth factor, PDGF)的培养亦同。加有下列因子的培养中有较多的RGC出现,计数为(细胞数/每10个显微镜野)：脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)：4.08;睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)：1.23;神经营养蛋白-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)：2.63;碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)：2.65。 结论 BDNF、NT-4/5、bFGF与CNTF在体外能改善人RGC之生存,而NGF、NT-3、EGF与PDＧF则不能。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 149-152)     

视网膜神经节细胞钾离子通道的表达与功能

视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）不可逆性凋亡是视神经损害的主要原因.在许多视神经相关疾病中如青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎和玻璃体视网膜病变等,RGCs凋亡是视觉障碍的一个主要原因.RGCs的电性能主要取决于离子通道的存在.各种离子通道中,钾离子通道起到了非常关键的作用.本文就钾离子通道在RGCs上的表达及其功能进行综述.     

腺相关病毒介导的脑源性神经营养因子对DBA／2J小鼠视网膜神经节细胞的保护作用

背景神经营养因子的缺乏与青光眼的视神经损害密切相关。外源性神经营养因子的补充具有短暂的保护作用。腺相关病毒（AAV）介导的神经营养因子可在眼内长期表达,但是否对青光眼动物的视神经具有持久的保护作用有待研究。目的评估AAV介导的脑源性神经营养因子（BDNF）基因在DBA／2J小鼠眼内的表达及其对视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法健康清洁级DBA／2J小鼠10只从4月龄起,每月使用Tonolab眼压计测量眼压。6月龄时左眼玻璃体腔内注射AAV介导的BDNF和绿色荧光蛋白（GFP）基因（AAV—BDNF—GFP）1μ1,右眼注射等量的生理盐水作为对照。注射后3个月心脏灌流后取出视网膜,荧光显微镜下观察GFP在视网膜中的表达,免疫组织化学法计算存活的RGCs数目并进行比较。结果DBA／2J小鼠4月龄时AAV—BDNF—GFP眼眼压平均为11．90mmHg,对照眼眼压为11．40mmHg。实验眼与对照眼眼压5月龄时均开始升高,8月龄时达到高峰。从4月龄到9月龄,实验组和对照组眼压比较差异无统计学意义（t=-1．78～0．61,P=0．11—0．90）。玻璃体腔注射AAV—BDNF—GFP3月龄后视网膜可以观察到GFP阳性细胞,转染率为46．33％±8．08％。AAV—BDNF—GFP组实验眼的平均RGCs的密度为（3168．13±1319．33）mm^2,对照眼为（2024．81±796．38）mm^2,差异有统计学意义（t=2．75,P=0．02）。结论AAV介导的BDNF对DBA／2J小鼠RGCs有保护作用。     

睫状神经营养因子对培养大鼠视网膜神经节细胞的影响

目的 观察不同浓度睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)对培养大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）生长、存活的影响。 方法 取15只生后2～3d Wistar大鼠视网膜组织进行细胞培养，通过Thy-1单克隆抗体免疫细胞化学对培养的RGC进行鉴定。实验分对照组和10、20、40 ng/mlCNTF组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组），记录RGC存活时间，将培养第3、5、7天的RGC行四甲基偶氮唑盐（methylthio tetrazole,MTT）法测量吸光度(A)值［旧称光密度(OD)］。 结果 Thy-1单克隆抗体免疫组织化学检查显示培养3d的存活细胞90%以上为RGC。细胞存活期间实验组与对照组细胞均无明显突起,细胞体积无明显增大，实验组细胞存活时间比对照组长3~4d。培养第5、7d，Ⅰ组A值分别为0.075 8±0.0139、0.0693±0.0113，Ⅱ组A值分别为0.0902±0.0114、0.0825±0.0125，Ⅲ组A值分别为0.0792±0.0133、0.0653±0.0086，对照组A值分别为0.0620±0.0071、0.0513±0.0068。实验组与同时间对照组A值相比差异有显著性的意义（Ⅱ组与对照组相比P＜0.01，Ⅰ、Ⅲ组与对照组相比P＜0.05）。 结论 一定浓度的CNTF能促进培养大鼠RGC的存活，对RGC形态无影响。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 283-285)     

CNTF和Ad-BDNF对视神经夹伤后视网膜神经节细胞存活的影响

目的:观察大鼠视神经夹伤后玻璃体腔内注射睫状神经营养因子(CNTF)和腺病毒介导脑源性神经营养因子(Ad-BDNF)对视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGC)存活的影响。方法:制作大鼠视神经定量夹伤模型,玻璃体腔内注射CNTF和Ad-BDNF,经上丘荧光金(FG)逆行标记RGC,计数视网膜铺片上的RGC并行统计学分析。结果:正常SD大鼠视网膜上RGC密度为2155±265个/mm2(n=12),视神经夹伤后RGC在1~2wk内下降速率最快,到3,4wk时RGC细胞数量虽仍有减少但下降速度已经明显减慢。CNTF组在视神经夹伤后1wk时视网膜RGC数显著高于对照组,但2~4wk的结果和对照组比较差异不明显。Ad-BDNF组视神经夹伤后1~4wk视网膜RGC数均显著高于对照组。结论:CNTF治疗组玻璃体腔内一次性注射CNTF可以在损伤早期2wk内为损伤的RGC提供神经营养因子,减少RGC的早期死亡。Ad-BDNF治疗组的这种保护作用可以持续到损伤后4wk,能够为RGC提供长时间地营养支持,但这种作用比较局限,可能与单一营养因子作用有关。     

睫状神经营养因子对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞突起再生的影响

目的观察睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）对纯化培养大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）突起再生的影响。方法取新生SD大鼠视网膜，消化并利用筛网纯化后接种于96孔板，加入不同浓度（10μg·L-1、20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1）CNTF作为实验组，不加CNTF作为对照。根据细胞形态及免疫细胞化学的方法鉴定细胞，观察RGCs生长规律，观测随机选取视野下的RGCs数和有突起细胞数（400倍荧光显微镜和相差显微镜）。结果 纯化的RGCs在含体积分数20％胎牛血清DMEM培养液中可存活30d。加入CNTF后3~5d，40μg·L-1组突起率显著高于对照组（P〈0.05）。7~15d，20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1组突起率显著高于时照组（P〈0.05），30μg·L-1、40μg·L-1组突起率显著高于10μg·L-1、20μg·L-1组（P〈0.05）。结论CNTF能显著促进RGCs突起再生，CNTF的浓度和突起率存在量效关系，一定浓度范围内．高浓度CNTF可较早促进突起再生。     

神經營養因子對混合培養鼠視網膜神經節細胞的影響

目的觀察兩種神經營養因子腦源性神經營養因子BDNF和碱性成纤維生長因子bFGF對混合培養鼠視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)的影響,并節選出其有效濃度.方法采用胰酶消化法將12衹生後2～3天的Sprague-Dawley(SD)乳鼠視網膜制成細胞悬液,接種于鼠尾原包被的96孔培養板(5×104個細胞/孔).分别加入各種濃度梯度的BDNF和bFGF,在37℃、5%CO2恒温培養箱中培養,于1、3、5天,用MTT微量自動比色法測量存活細胞的吸光度A值.用Thy-l抗體、NSE抗體和GFAP抗體進行細胞免疫化學檢查以鍳定RGCs.結果培養在鼠尾原上的細胞生長良好,大部分伸出突起.培養1天、3天,各種濃度的BDNF和bFGF實驗組吸光度A值舆對照組比較均具有顯著性差异(p<0.01,p<0.05);培養5天,BDNF(40ng/ml、50ng/ml)、bFGF(15ng/ml)和BDNF+bFGF組吸光度A值高于對照組,具有顯著性差异(P＜0.01,P＜0.05).結論各種濃度的BDNF和bFGF均能促進鼠RGCs在體外的存活,BDNF具有濃度依賴性,BDNF的作用優于bFGF;同時應用BDNF和bFGF無叠加作用.     

干细胞移植治疗视网膜神经节细胞损伤性疾病的研究进展

视网膜神经节细胞是视觉形成的重要参与者。视网膜神经节细胞损伤或死亡往往会导致视功能不可逆转的损害。青光眼、糖尿病视网膜病变、高血压、视网膜变性等致盲性疾病,均会引起视网膜神经节细胞损伤或进行性大量凋亡。目前此类疾病在临床上尚无明确的治疗方法。为了恢复患者视网膜神经节细胞功能,国内外学者将研究焦点集中在干细胞移植上。干细胞移植主要指两大类,一类是基于干细胞的替代治疗,另一类则是通过干细胞移植促进某些因子分泌来保护视网膜神经节细胞。我们旨在对干细胞移植治疗视网膜神经节细胞损伤疾病的潜力进行综述,并着重讨论不同种干细胞分化为视网膜神经节细胞的研究进展。     

蛇毒神经生长因子对体外培养鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的研究蛇毒神经生长因子（venom nerve growth factor，vNGF）对离体培养的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的存活和轴突再生的影响。方法采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养技术，加入不同浓度的vNGF，通过检测细胞的活力选择一个最佳浓度进行培养，行抗Thy-1．1免疫细胞化学染色，观察RGCs在体外的存活时间,比较实验组和对照组的RGCs个数、胞体直径和轴突长度。结果vNGF的最佳浓度是80μg.L，用该浓度作用于细胞，实验组与对照组细胞存活时间分别为13～14d和7～8d，轴突长度分别为（111.78±10.65）μm和（78.73±8.23）μm。阳性细胞个数分别为（224.23±3.83）个和（182.47±2.79）个。结论vNGF能促进体外视网膜神经细胞和RGCs的存活以及轴突的伸长，有视神经保护作用。     

视网膜神经节细胞多种培养方法的实验研究

目的探讨视网膜神经节细胞（ＲＧＣｓ）的多种培养方法。方法（１）在涂有鼠尾胶原的器皿上通过调整培养液培养：①乳鼠混合及纯化的ＲＧＣｓ；②单层星型胶质细胞上种植纯化的乳鼠ＲＧＣｓ；③引产胎儿混合ＲＧＣｓ。（２）检验鼠尾胶原及中脑顶盖提取液（Ｔｅ）对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的影响。结果（１）混合培养的乳鼠及引产胎儿ＲＧＣｓ大多能存活２周以上；（２）纯化的乳鼠ＲＧＣｓ大多能存活４８ ｈ；（３）单层星型胶质细胞上种植的纯化乳鼠ＲＧＣｓ能存活４周以上；（４）鼠尾胶原及Ｔｅ对培养的乳鼠ＲＧＣｓ的贴壁及生长有明显的促进作用。结论通过调整培养液及改善微环境能用多种方法培养ＲＧＣｓ。     

Neuroprotective effects of BDNF and GDNF in intravitreally transplanted mesenchymal stem cells after optic nerve crush in mice

AIM: To assess the neuro-protective effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on retinal ganglion cells (RGCs) following optic nerve crush in mice. METHODS: C56BL/6J mice were treated with intravitreal injection of PBS, BMSCs, BDNF-interference BMSCs (BIM), and GDNF-interference BMSCs (GIM) following optic nerve crush, respectively. The number of surviving RGCs was determined by whole-mount retinas and frozen sections, while certain mRNA or protein was detected by q-PCR or ELISA, respectively. RESULTS: The density (cell number/mm2) of RGCs was 410.77±56.70 in the retina 21d after optic nerve crush without any treatment, compared to 1351.39±195.97 in the normal control (P<0.05). RGCs in BMSCs treated eyes was 625.07±89.64/mm2, significantly higher than that of no or PBS treatment (P<0.05). While RGCs was even less in the retina with intravitreal injection of BIM (354.07+39.77) and GIM (326.67+33.37) than that without treatment (P<0.05). BMSCs injection improved the internal BDNF expression in retinas. CONCLUSION: Optic nerve crush caused rust loss of RGCs and intravitreally transplanted BMSCs at some extent protected RGCs from death. The effect of BMSCs and level of BDNF in retinas are both related to BDNF and GDNF expression in BMSCs.     

培养大鼠视网膜神经节细胞的形态学与电生理学特性

目的比较不同培养天数大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)形态学特性与电生理功能,探讨其形态与功能的最佳培养时期。方法采用出生后0dLong Evans大鼠,取视网膜培养神经节细胞,分别于培养后第1d、4d、7d3个时间点观察细胞形态,并行膜片钳全细胞记录研究其静息膜电位(resting membrane potential,RMP)和动作电位(action potential,AP)的阈值、幅度及波宽。结果共记录到53个RGCs,根据AP类型RGCs分为单峰型(39个)、瞬变型(11个)和持续型(3个),其中以单峰型为主(占73.6%)。培养1d RGCs不易诱发AP,多数细胞需增加刺激强度后方可诱发出AP;培养4d时绝大多数RGCs给予20PA的刺激即可诱发出AP;培养7d时虽较容易诱发AP,但由于此时细胞存活状态较差,部分细胞(共记录28个细胞,其中8个不能诱发AP)给予不同强度的刺激,均不能诱发出AP。不同培养时期的RGCs静息膜电位和AP的特性无显著差异。结论随着培养时间的延长RGCs形态逐渐趋于成熟,但电生理功能仍处于幼稚状态;培养4d的RGCs形态和电生理状态最好。     

N-甲基-D-天门冬氨酸对大鼠视网膜神经节细胞层神经元的损伤作用

目的 探讨N—甲基—D—天冬氨酸(NMDA)对大鼠视网膜神经节细胞层(RGCL)神经元的毒性作用。方法 通过大鼠玻璃体内注入不同浓度的NMDA，观察注射前后不同时间视网膜神经节细胞层的神经元计数。结果 大鼠RGCL神经元计数随NMDA浓度增加及时间延长而逐渐减少。其中以大神经元对NMDA兴奋毒性最敏感。结论 NMDA可导致RGCL神经元损伤，并显示以大神经元最先受损，即与青光跟性视神经损伤相似，此模型可应用于研究青光跟性视神经损伤机制。     

一种稳定标记小鼠视网膜内两种不同类型神经节细胞的方法

目的 报道一种简单高效显示小鼠视网膜中两种不同类型神经节细胞的方法.方法 利用特殊标记物Brn3a和Melanopsin,通过视网膜铺片免疫荧光双标染色结合激光共聚焦显微镜,分别标记小鼠视网膜中普通视网膜神经节细胞和内在光敏视网膜神经节细胞.结果 免疫荧光染色结果表明,内在光敏视网膜神经节细胞与普通视网膜神经节细胞均位于视网膜节细胞层,相间互补分布.内在光敏视网膜神经节细胞数量较少,为普通视网膜神经节细胞的1％ ～2％,其轴突朝向视神经盘方向汇集,树突野较大,伸向内网层.结论 免疫荧光双标染色是小鼠视网膜内两种不同类型视网膜神经节细胞简单易行、稳定高效的标记方法.     

Latanoprost protects rat retinal ganglion cells from apoptosis in vitro and in vivo

We investigated whether latanoprost has a direct anti-apoptotic effect in retinal ganglion cell (RGC) line and RGCs in the rat. RGC-5 cells were induced to undergo apoptosis by serum deprivation and exogenous glutamate. The level of cell death with or without latanoprost acid was monitored by an XTT assay and by immunocytochemistry with activated caspase-3. Changes in the level of intracellular calcium ([Ca²⁺]i) were measured with fluo-4 fluorescence. The XTT assay revealed that latanoprost acid increased RGC-5 cell viability. Latanoprost acid significantly reduced caspase-3 positive cells and suppressed [Ca²⁺]i evoked by glutamate. U0126, a mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 inhibitor, partially blocked the rescue effect of latnanoprost acid (p = 0.013). In vivo, rat RGCs were degenerated by optic nerve crush. After topical instillation of latanoprost for 7 days, RGCs labeled with fluorogold were significantly. Retinal flatmounts were subjected to terminal dUTP nick end labeling (TUNEL) staining to detect apoptotic cells. TUNEL-positive cells were significantly decreased in eyes with topically instilled latanoprost (p = 0.015). These data suggest that latanoprost has an neuroprotective ability in RGCs.