尾静脉高压注射质粒DNA后体内表达的规律

目的研究小鼠尾静脉高压注射质粒DNA后，目的基因在体内分布表达的规律，以及该方法的转基因效率。方法将LacZ质粒按小鼠体重比稀释到一定的PBS中，经尾静脉快速高压注射导入小鼠体内，通过X-gal染色的方法在不同时间点观察目的基因在肝脏和其他脏器中的分布规律。结果含有CMV启动子的LaeZ裸质粒经小鼠尾静脉高压注射途径导入体内，24h后即开始表达，第3天出现表达高峰，1周后表达消失，基因转染率达5％-6％；用脂质体包裹质粒DNA后，再进行尾静脉高压注射，质粒在肝脏的表达效率可达18％-20％。结论应用尾静脉高压注射脂质体／质粒DNA复合物途径，目的基因在小鼠肝脏获得高效表达，该方法可以广泛应用于基因治疗的实验研究。     

流体力学注射介导的重组pcDNA-IFN-λ3-EGFP质粒在小鼠体内的表达

目的研究流体力学尾静脉注射对目的基因器官靶向性的影响。方法将BALB/c小鼠按随机数字表分组法分为流体力学注射组和空质粒对照组。流体力学注射组将100μg/只带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的表达质粒pcDNA-IFN-λ3-EGFP溶液2ml在5s内快速注入尾静脉,对照组在5s内注入空质粒pcDNA3.1的生理盐水2ml。注射后在不同时间内用过量麻醉剂处死小鼠,取肝、肺、肾、心、脑等组织作冰冻切片,于荧光显微镜下观察。结果流体力学注射pcDNA-IFN-λ3-EGFP质粒在肝组织中表达IFN-λ3-EGFP融合蛋白,注射8h后即有较强的表达,24h后表达最强,2d后明显减弱,1周后消失。其他组织及对照组未检测到绿色荧光蛋白表达。结论流体力学注射方法是肝靶向性的活体基因转移方法,绿色荧光蛋白可作为该方法进行目的基因研究的一个可靠和方便的示踪剂。     

部分切肝对大鼠肝细胞门静脉途径转基因效率的影响

目的探讨70％切肝对大鼠肝细胞门静脉途径转基因效率的影响。方法Wistar大鼠70％切肝［假手术组(sham operation,S)仅行开腹术］建立肝再生模型,术后24h肝隔离门静脉注射脂质体-质粒DNA复合物(lipofectamine-pEGFP-N1DNAcomplexes,lipoplexes)转绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因至肝细胞,对照组注射生理盐水(NS)。转染后4d(分4组,每组5只切肝并于门静脉注射lipoplexes组,He4;切肝并于门静脉注射NS组,Hc4;假手术并于门静脉注射lipoplexes组,Se4;假手术并于门静脉注射NS组,Sc4)、转染后15d(与转染后4d的对应分组为He15;Hc15;Se15;Sc15)均以胶原酶消化、Percoll液梯离心法获取纯化肝细胞悬液;以NS组为对照并以GFP为荧光标记物,用流式细胞仪(flow     

腹腔途径时脂质体和糖化多聚赖氨酸对外源基因肝脏靶向导入性能的比较

目的　比较脂质体和糖化多聚赖氨酸经腹腔途径时对目的基因肝脏靶向定位效果的影响。方法　将真核细胞表达质粒分别与脂质体和糖化多聚赖氨酸偶联 ,经腹腔注射导入大鼠体内 ,通过原位杂交和免疫组化的方法观察目的基因在肝脏和其他脏器的分布表达。结果　经脂质体或糖化多聚赖氨酸包埋的质粒DNA导入体内2 4h后均见明显表达 ,1周后逐渐下降 ,3周时仍有表达 ;均以肝脏为主要分布器官 ,但用糖化多聚赖氨酸包埋的质粒在肝脏中的分布表达高于使用脂质体的包埋 ,在其他脏器中的分布表达低于使用脂质体的包埋。结论　腹腔途径时糖化多聚赖氨酸对DNA的肝脏靶向定位效果优于脂质体。     

StarburstTM Polyamidoamine Dendrimers介导的绿色荧光蛋白基因在小鼠体内的表达分布及对恶性疟DNA 疫苗ES312免疫原性的影响

目的研究StarburstTM Polyamidoamine(PAMAM)dendrimers介导绿色荧光蛋白基因在小鼠体内的表达分布及对恶性疟DNA疫苗ES312免疫原性的影响.方法经股四头肌给小鼠注射StarburstTM PAMAM dendrimers与绿色荧光蛋白基因或恶性疟DNA疫苗ES312的复合物.通过流式细胞术、Western blot和间接免疫荧光方法检测绿色荧光蛋白的表达分布和表达量.用ELISA方法检测恶性疟DNA疫苗ES312的免疫原性.结果在注射StarburstTMPAMAM dendrimers/DNA复合物后2 h～7 d内,StarburstTM PAMAM dendrimers携带的绿色荧光蛋白基因的表达在小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉中均能被检测到,在肾总蛋白中所占百分比最高,且各器官管腔内皮细胞中的绿色荧光蛋白表达量较高.小鼠的脑和肾中,在StarburstTM PAMAM dendrimers的存在下,绿色荧光蛋白基因的表达量明显高于裸DNA的表达量.经StarburstTM PAMAM dendrimers携带的恶性疟DNA疫苗ES312诱导的抗体反应水平明显高于单纯裸DNA疫苗所诱导的抗体水平.结论StarburstTM PAMAM dendrimers作为一种低抗原性、非病毒的新型DNA载体,能够明显提高裸DNA在体内的表达水平,诱导产生很强的体液免疫反应.但是,StarburstTM PAMAMdendrimers/DNA复合物在各组织器官中的广泛分布,尤其是透过血脑屏障的能力,已超出疫苗载体的适用范围.作为DNA疫苗载体,要对现有StarburstTM PAMAM dendrimers分子的结构做进一步的修饰.     

不同剂量不同载体不同途径的肝再生增强因子重组质粒抗大鼠肝纤维化疗效比较

目的 筛选肝再生增强因子重组质粒基因治疗时较优的载体、途径和剂量及三者的最佳组合.方法 制备肝纤维化大鼠模型,L9(33)正交设计分组,用3种不同的载体(裸基因、脂质体、多聚物)携带不同量(50、100、200μg/kg)的肝再生增强因子重组质粒,采用3种给药途径(肌肉注射、静脉注射、腹腔注射)对模型大鼠进行干预,通过肝组织病理学、肝纤4项等指标来判断疗效并进行对照.结果剂量因素:200μg/kg组纤维化半定量计分和肝纤4项综合得分明显低于50μg/kg组和100μg/kg组,但50μg/kg组和100μg/kg组的结果无显著性差异.载体因素:裸基因组、脂质体组和多聚赖氨酸组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异.脂质体组和多聚赖氨酸组的肝纤4项综合得分均明显低于裸基因组.途径因素:肌肉注射组、静脉注射组和腹腔注射组3组之间的纤维化半定量计分均无显著性差异.腹腔注射组的肝纤4项综合得分明显高于肌肉注射组和静脉注射组.结论 200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效优于100μg/kg和50μg/kg;由脂质体携带DNA和由多聚物携带DNA的疗效明显优于裸DNA.肌肉注射和静脉注射的疗效明显优于腹腔注射.由脂质体或多聚物携带、静脉或肌肉注射200μg/kg的肝再生增强因子重组质粒,能取得较好的抗大鼠免疫性肝纤维化的疗效.     

脂质体介导质粒pcDNA3.1/ KDRn3基因在转染小鼠视网膜组织中的表达及定位

目的：将真核表达质粒pcDNA3.1/ KDRn3以脂质体介导转染C57BL/6J小鼠视网膜组织,观察其表达及定位。方法：首先对真核表达质粒pcDNA3.1/KDRn3进行扩增和酶切鉴定,然后将20只健康C57BL/6J小鼠随机分成对照组及玻璃体腔注射后2、5、7和14 d组,每组4只鼠8眼。注射组每眼玻璃体腔注射脂质体pcDNA3.1/ KDRn3复合物1 μL,分别于注射后2、5、7及14 d摘除眼球,制成石蜡切片,用KDRn3蛋白免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察KDRn3蛋白表达及定位。结果：Xho Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切,切下900 bp大小片段,与目的片段大小一致,表明该质粒确实为KDRn3。注射后2 d在视网膜神经节细胞层细胞胞浆内可见红色荧光信号,注射后5和7 d组视网膜神经节细胞层、内核层部分细胞胞浆内可见红色荧光信号;注射后14 d视网膜神经节细胞层、部分内核层细胞胞浆内可见红色荧光信号,但发出红色荧光信号的细胞数明显减少。　结论：阳离子脂质体可有效将pcDNA3.1/ KDRn3基因转染小鼠视网膜组织,并得到持续表达。     

不同转染途径对慢病毒载体基因在大鼠肝脏中表达的影响

目的研究慢病毒载体基因在肝脏内转染的有效途径。方法本实验根据大鼠消化系统解剖,设计利用经回盲部回结肠静
脉穿刺置管至门静脉作为转染途径。通过观察对比尾静脉转染途径大鼠肝脏荧光蛋白表达、基因表达及转氨酶变化情况,探讨
不同转染方法的有效性和安全性。结果门静脉转染组和尾静脉转染组大鼠均存活。转染后96 h慢病毒载体携带绿色荧光蛋
白在门静脉转染组肝脏呈高表达,14 d后仍有持续表达;尾静脉转染组术后96 h荧光蛋白表达较门静脉组弱,14 d后几无持续
表达。RT-PCR检测转染基因LXRα-RNAi效率：转染组LXRα mRNA表达均有下调,门静脉转染组LXRα基因敲减率明显高于
尾静脉转染组（0.135±0.002 vs 0.713±0.036,P<0.05）,两组血清ALT比较差别无统计学意义。结论经门静脉灌注是基因转染的
有效途径,经回盲部回结肠静脉属支穿刺置管可在保证大鼠存活的情况下提高基因转染率,且对肝功能无明显损害,是值得推
广的方法。     

人AFP全长基因编码序列的克隆及表达

目的 构建人AFP全长基因编码序列的真核表达质粒,并在CHO及小鼠肌肉组织中表达。方法 从人胎肝组织中提取AFP基因,以全长基因序列为目的基因片段,真核表达质粒pcDNA3．1( )为载体,构建AFP重组质粒phAFP,经酶切分析和DNA测序对phAFP进行鉴定。重组质粒phAFP经脂质体转染真核细胞CHO以及直接注射小鼠胫前肌,并采用免疫荧光染色及免疫组化对其表达产物进行检测。结果 获取的AFP基因片段与GenBank报道的序列一致,确认为人AFP基因的全长编码序列,构建的重组质粒phAFP能在体外真核细胞CHO、体内肌细胞中有效表达。结论 成功构建了能在真核细胞中表达的重组质粒phAFP,为AFP DNA疫苗治疗肝癌的研究打下基础。     

pEGFP-NeuroD重组质粒在肝癌细胞中的表达及其功能探讨

目的:利用含绿色荧光蛋白的重组表达质粒pEG-FP-NeuroD做基因转染,观察其在肝癌细胞(HepG2)中的表达,探讨其在体外诱导肝细胞分泌胰岛素的可能性.方法:将酶切验证正确的重组质粒pEGFP-NeuroD,用脂质体法转染3种不同葡萄糖浓度培养的HepG2细胞,荧光显微镜下观测各组绿色荧光蛋白的表达情况;采用RT-PCR方法检测HepG2细胞中NeuroD-1及insulin mRNA的表达;采用Western Blot方法检测EGFP-NeuroD融合蛋白的表达.结果:①重组质粒体外成功转染入HepG2细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,重组质粒转染率在30%～40%之间;②RT-PCR方法及Western Blot在3种不同葡萄糖浓度培养的细胞组中均榆测到NeuroD-EGFP融合蛋白的表达,其中RT-PCR方法扩增出NeuroD-1目的片段大小为634 bp,而融合蛋白Mr大小约为67×103,但是3组间蛋白表达量均无明显差异;③RT-PCR法未检测到肝癌细胞胰岛素的分泌.结论:重组表达质粒pEGFP-NeuroD可体外转染入HepG2细胞,功能探讨提示单一NeumD-1表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素.     

小鼠尾静脉注射与心肌注射腺病毒载体转染效率的比较

目的比较小鼠尾静脉注射或心肌注射腺病毒载体后心脏组织和肝脏组织中靶基因的转染效率。方法构建表达绿色荧光蛋白GFP的腺病毒载体(GFP-Ad)。C57BL/6小鼠20只随机分为尾静脉注射腺病毒载体组与心肌注射腺病毒载体组各10只,用实时定量PCR检测不同时间点小鼠心肌组织和肝脏组织中GFP的mRNA表达水平,并且通过荧光显微镜观察GFP荧光表达情况。结果心肌注射腺病毒载体组心脏组织中GFP的mRNA表达水平明显高于尾静脉注射腺病毒载体组,心肌注射腺病毒载体组心脏组织中荧光强度明显增强。同时,我们发现两组的肝脏组织中GFP的mRNA表达水平和荧光强度均明显高于心脏组织中;且在尾静脉注射腺病毒载体组,肝脏组织中GFP的mRNA表达水平和荧光强度在7 d达高峰,而心肌注射腺病毒载体组则在3 d达高峰。结论提高心脏组织中靶基因的转染效率宜采用心肌注射腺病毒载体的方法;对于肝脏组织转染效率,两种注射方法均可,鉴于尾静脉注射腺病毒载体的方法创伤小,宜采用。     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内定居能力初步研究

目的探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）经不同途径移植到同种异体大鼠后其定居于肝脏的能力。方法从大鼠骨髓中分离培养获取MSCs，以绿色荧光蛋白进行标记，体外扩增后，分别从大鼠尾静脉和门静脉注入同种异体正常和肝脏损伤大鼠体内，于移植后的第3、7天通过荧光定量PCR检测移植的MSCs在大鼠肝内的表达情况。结果所有大鼠移植同源异体MSCs后全部存活，无意外死亡。从门静脉、尾静脉注入MSCs，在大鼠肝脏受损时其定居量大于非肝脏受损大鼠（P〈0．05）。在肝细胞受损大鼠，从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较肝脏定居量差异不显著（P〉0．05）。非肝脏受损大鼠，从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较细胞定居于肝脏量差异显著（P〈0．05）．并与移植后时间有关。结论干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损伤关系密切．与移植途径关系不密切；在正常动物干细胞可定居于肝脏，定植的细胞量与移植途径和移植后时间有关。     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内定居能力初步研究

目的 探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)经不同途径移植到同种异体大鼠后其定居于肝脏的能力。方法 从大鼠骨髓中分离培养获取MSCs,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,分别从大鼠尾静脉和门静脉注入同种异体正常和肝脏损伤大鼠体内,于移植后的第3、7天通过荧光定量PCR检测移植的MSCs在大鼠肝内的表达情况。结果 所有大鼠移植同源异体MSCs后全部存活,无意外死亡。从门静脉、尾静脉注入MSCs,在大鼠肝脏受损时其定居量大于非肝脏受损大鼠(P<0.05)。在肝细胞受损大鼠,从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较肝脏定居量差异不显著(P>0.05)。非肝脏受损大鼠,从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较细胞定居于肝脏量差异显著(P<0.05),并与移植后时间有关。结论 干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损伤关系密切,与移植途径关系不密切;在正常动物干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径和移植后时间有关。     

不同入肝血流阻断方式对小鼠肝癌生长和转移的影响

目的探讨不同血流阻断方式对肝癌生长和转移的影响。方法选择昆明小鼠24只,随机分为正常对照组(suspended operation,SO)、肝门阻断组(occlusion of the portal triad,OPT)、保留肝动脉持续阻断门静脉组(occlusion of portal vein,OPV)各8只。采用门静脉注射肿瘤的方法建立肝癌模型,建模后3d采用阻断范围为左外叶和中叶、阻断时间为60min的入肝血流阻断方式,复流后5d分别对三组动物测定肝脏置换区域(HRA)、增殖性细胞核抗原(PCNA)在肝癌组织中的阳性表达率。结果门静脉注射小鼠肝癌细胞8d后,对照组阻断叶HRA(%)值为7.658±2.552,OPT组升高到35.612±4.234,OPV组升高到9.02±3.006(P<0.01);对照组非阻断叶HRA(%)值为8.107±2.003,OPT组升高到8.698±3.021,OPV组升高到8.607±2.304(P<0.01)。对照组中阻断叶与非阻断叶肿瘤生长比率为1,OPT组值为2.82,OPV组值为1.1。对照组中肿瘤细胞PCNA阳性表达率为30%,OPT组为78%,OPV组为45%。结论保留肝动脉持续阻断门静脉可减缓肝癌的生长和转移。     

恒磁场对Feridex-GFP 双标记BMSC 在损伤肝脏中定植的影响

目的：评价体外恒磁场作用下,双标记干细胞经外周静脉、门静脉、肝动脉移植在损伤肝脏中的定植 率及治疗急性肝损伤的有效性。方法：分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),经培 养传代纯化、体外诱导,分化为肝样细胞,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和菲立磁(Feridex)体外双标 记BMSCs,不同途径移植双标记BMSCs至肝脏,于移植后第1,2,3,4周处死大鼠,测定血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)水平,并取肝组织做苏木精-伊红染色(HE染色)、荧光显微镜下观 察肝内GFP阳性率。结果：双标记BMSCs通过尾静脉、门静脉、肝动脉3种途径及其外加恒磁场作用下,移植后第4周 均能定植于肝脏,改善肝功能;在远期疗效不变的前提下,肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组促进肝 功能的早期恢复。结论：BMSCs移植可有效治疗急性肝损伤,首选经门静脉+恒磁场、肝动脉+恒磁场途径,次选外 周静脉或外周静脉+恒磁场途径。     

鼻咽癌细胞株裸鼠肝异位种植瘤肺转移动物模型的建立

目的建立鼻咽癌细胞株肝异位种植瘤肺转移裸鼠的动物模型。方法24只裸鼠分别通过门静脉（门静脉组）或肝包膜下（肝包膜组）注射鼻咽癌细胞株C666-1细胞悬液，建立鼻咽癌细胞株肝异位种植瘤肺转移裸鼠动物模型，3周后每组随机处死6只裸鼠，观察裸鼠腹水、肝脏成瘤、肺转移等情况，其余裸鼠观察其生存期。结果门静脉组和肝包膜组肝脏成瘤率、腹水形成率均为100％，肺转移率分别为66．7％和58．3％，两组经卡方检验差异无显著意义（P〉O．05）。平均生存期分别为（25．17士5．15）d及（22．50士3．89）d，经log-rank时序检验差异无显著性意义（P〉O．05）。结论两种方法均能成功建立鼻咽癌细胞株肝种植瘤肺转移裸鼠的动物模型。     

HCV感染树鼩模型中腹部横切手术及肝门静脉注射新方法的建立

目的采用腹部横切手术及肝门静脉注射法将丙型肝炎病毒（hepatitis c virus,HCV）迅速足量注射接种到树鼩体内肝脏,提高HCV对树购的感染率。方法采用横切打开树购腹腔,找到肝门静脉,进行肝门静脉注射接种HCV,手术后1周进行采血、ALT检测、HCV病毒载量检测、肝脏病理检测及HCV-RNA抗原检测。结果横切手术及肝门静脉注射20只树鼩,手术后经护理恢复,树购伤口恢复良好,手术成功率及肝门静脉注射准确率均达100％,保证HCV完全快速进入树鼩肝脏。有60％（12／20）树鼩出现一过性的病毒血症或间歇性病毒血症,感染树鼩的病毒载量最高可达到1×10^5拷贝／mL,肝功能中ALT指标最高可达到192μ／L,肝脏活体组织病理检查发现不同程度的肝炎症状,肝组织能检测到HCV-RNA抗原。结论腹部横切具有充分暴露肝门静脉、操作方便、符合解剖生理、组织创伤较小、伤口易于愈合等优点,适用于肝门静脉注射,同时提高了感染率,该技术方法为进一步深入研究HCV感染树鼩奠定基础,对于其它相关实验动物和动物实验具有一定借鉴经验和参考价值。     

门脉局部注入DDPH治疗大鼠肝硬化门脉高压的实验研究

目的 研究l—(2，6—二甲基苯氧基)—2—(3，4—二甲氧基苯乙氨基)丙烷盐酸盐(DDPH)对实验性大鼠肝硬化门脉高压症的治疗作用，探讨合适的药物及给药途径。方法 在CCl4诱发的大鼠肝硬化门脉高压模型上，分别经下腔静脉或门静脉注入哌唑嗪(PRZ)，维拉帕米(VER)和DDPH，测量门静脉压(PVP)、下腔静脉压(ICVP)、平均动脉压(MAP)和心率(HR)，比较两种给药途径对门脉和全身血流动力学影响的特点，并观察DDPH对肝纤维化的防治作用。结果 门脉注入DDPH使PVP、MAP下降，并呈剂量依赖性，PRZ随剂量增加降PVP、MAP作用呈逐渐减弱的趋势，VER降PVP、MAP作用最弱，减慢HR作用最强。DDPH门脉给药后PVP下降，50min时仍无明显恢复，其它2种药物停止注药后PVP开始恢复，50min时降压作用基本消失；3种药物门脉给药降PVP作用明显强于下腔静脉给药，降MAP作用则明显弱于后者，对HR影响均较小；DDPH可以减轻CCl4对肝细胞的损害和肝纤维化的程度。结论 DDPH是理想的治疗肝硬化门脉高压症的扩血管药物，门脉是扩血管药物治疗门脉高压症的理想途径。     

小鼠胰岛细胞分离纯化后门静脉注射肝内移植模型的建立

目的建立高效。高纯度小鼠胰岛细胞分离纯化，经小鼠门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内移植方法。方法动物手术放大镜下，采用小鼠胆总管内灌注胶原酶方法消化，非连续梯度离心液离心，纯化胰岛，立体显微镜下用将胰腺外分泌组织、腺泡、淋巴结、导管组织吸走，胰岛计数后门静脉注射移植到同种异体受体小鼠肝内。结果胰岛分离时间约180min，纯化后每只小鼠可获200个胰岛。同系胰岛移植后1～2d，糖尿病小鼠血糖下降至11．1mmol／L以下。结论小鼠胰腺采用胆总管灌注胶原酶方法消化的方法可提高胰岛细胞的收获量、纯度和活性，采用门静脉注射移植到同种异体小鼠肝内可明显降低糖尿病小鼠血糖值，这一模型的建立可为今后进行人胰岛小鼠移植提供有价值的实验依据。