Survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖影响实验研究

目的：探讨慢病毒载体介导survivin siRNA对人肺腺癌A549细胞增殖的影响及其作用机制，为肺癌基因治疗新策略提供帮助。方法:构建表达survivin-siRNA的慢病毒载体感染A549细胞株，测定病毒滴度。采用RT-PCR、免疫组化及Western blotting等检测感染后不同分组A549细胞survivin-mRNA和蛋白的变化及caspase-3蛋白的变化，通过流式细胞仪及MTT法检测感染后A549细胞周期及生长曲线。结果: RT-PCR及Western blotting检测显示，转染细胞(MOI=150)中survivin基因mRNA和蛋白的表达明显降低，抑制率分别为97%、88%；细胞生长曲线和周期结果显示转染组细胞增殖明显减慢，G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例则明显减少；转染细胞中caspase-3被激活。结论: 慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制人肺腺癌A549细胞survivin基因的表达和细胞增殖，有效激发细胞凋亡，有望成为肺腺癌基因治疗的新策略之一。     

WWOX基因在肺腺癌中表达及对A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究WWOX基因在肺腺癌组织的表达及在肺腺癌细胞系A549细胞增殖和凋亡的作用,探讨肺腺癌与临床病理特征之间的关系。方法应用免疫组化技术检测62例肺腺癌组织WWOX蛋白的表达;将携有WWOX基因的表达载体转染肺腺癌细胞系A549细胞,用Western blot法检测A549细胞WWOX蛋白的表达情况;运用细胞计数法检测细胞的增殖情况;流式细胞仪观察其对A549细胞凋亡的影响。结果肺腺癌组中WWOX的阳性表达率为45.2%,明显低于癌旁正常组织(82.9%,=0.000)。WWOX在肺腺癌的表达与分化程度(=0.023)、TNM分期(=0.007)、远处转移有关(=0.009),与患者的性别、年龄以及肿瘤的大小无关(0.05)。A549细胞转染WWOX基因后,WWOX蛋白表达明显高于空载质粒组及未转染组(未检测到WWOX蛋白的表达);生长曲线可见pcDNA3.0-WWOX转染组的A549细胞的增殖速度比pcDNA3.0组和未转染组明显下降;流式细胞仪分析表明pcDNA3.0-WWOX转染组的凋亡率明显高于pcDNA3.0空载体组。结论 WWOX的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

二甲基亚砜通过激活caspase-3以及抑制PARP-1引起A549细胞凋亡

目的 检测肺上皮癌细胞（A549）细胞经二甲基亚砜（DMSO）诱导发生凋亡后聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶（PARP-1）的活性是否受到抑制。方法 通过MTT法检测caspase-3的活性升高以及TUNEL等方法验证二甲基亚砜可引起A549细胞凋亡后,采用western blotting 验证PARP-1是否被切割成俩个片段。结果 DMSO可诱导A549细胞发生凋亡,凋亡过程中caspase-3的活性上调,其下游底物PARP-1大量被切割成小片段。结论 DMSO诱导的A549细胞凋亡受到caspase-3-PARP-1信号分子的调节。     

CIK细胞对A549肺癌细胞株的抗增殖及诱导凋亡作用的形态学研究

目的 研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对A549肺癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用.方法 应用MTT法检测CIK细胞对肺癌细胞株的抗增殖作用的影响及细胞毒活性;通过倒置显微镜、HE染色、AO/EB荧光染色、透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变.结果 MTT比色法表明随着CIK细胞与肺癌细胞效靶比增加及作用时间延长,抑制率明显增强(P<0.01).CIK细胞作用于肺癌细胞24 h后,形态学观察肺癌细胞发生凋亡或坏死.结论 体外制备的CIK细胞对肺癌A549细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用.     

抗菌肽merecidin诱导人肺腺癌细胞系A549凋亡

目的探讨抗菌肽merecidin对人肺癌细胞系A549的作用及其机制。方法实验分为对照组(Ctrl)、顺铂干预组(cisplatin 40μmol/L)、merecidin干预组(merecidin 25/35μmol/L)、caspase抑制剂组(z-VAD-fmk)、caspase抑制剂+merecidin干预组(z-VAD-fmk+merecidin 25/35μmol/L)。MTT法检测细胞增殖,annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,Western blot检测caspase-3、8、9、激活型caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果抗菌肽merecidin明显抑制A549细胞增殖(P0.05),merecidin处理24 h后的IC_(50)值为34.8μmol/L。与Ctrl组相比,merecidin干预组的凋亡率显著升高(P0.05);与merecidin干预组相比,caspase抑制剂+merecidin干预组的凋亡率并没有下降。caspase-3、8、9蛋白表达无显著变化且未检测到激活型caspase-3蛋白表达。Bcl-2蛋白表达下调(P0.05)及Bax蛋白表达增多(P0.05)。结论抗菌肽merecidin可以抑制人肺腺癌细胞A549的增殖并诱导其凋亡。     

3-溴丙酮酸通过抑制糖酵解阻止A549肺腺癌细胞增殖并诱导其凋亡

目的 探究3-溴丙酮酸(3-BP)对人肺腺癌A549细胞的增殖和凋亡的影响及机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)法检测(10、20、40、80、160) μmol/L 3-BP处理24、48 h,对肺腺癌A549细胞存活率的影响;采用(0、50、100、150) μmol/L 3-BP处理肺腺癌A549细胞24 h,异硫氰...     

pcEgr-hp53稳定转染联合X射线诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及相关凋亡蛋白表达变化

目的：探讨辐射诱导表达载体pcEgr-hp53体外稳定转染人肺腺癌A549细胞后联合X射线照射,诱导细胞凋亡的作用及相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达的变化。方法：以脂质体介导携有外源野生型p53基因的辐射诱导表达载体pcEgr-hp53和pcDNA3.1,体外转染A549细胞,筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养,所表达的A549-hp53和A549-vect分别接受0、0.5、2和5Gy X射线照射,即8个实验组,采用TUNEL法和流式细胞术检测稳定转染联合辐射对细胞凋亡和Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达变化的影响。结果：A549-hp53组加不同剂量照射与0 Gy组比较,其百分数均明显增加（0.5-5Gy,P〈0.05-P〈0.01）,Bcl-2蛋白表达在0.5-5Gy时明显下降,而Bax蛋白明显增加（P〈0.05-P〈0.01）,caspase-3蛋白表达在2-5Gy时明显增加（P〈0.01）;A549-hp53照射组不同剂量照射,与A549-vect相应照射剂量组比较,其百分数在0.5Gy时无明显差异,在2-5 Gy时为（P〈0.01）,Bcl-2蛋白表达明显下降（0.5Gy,P〈0.01;2-5Gy,P〈0.05）,Bax和caspase-3蛋白表达0.5-5Gy时明显增加（P〈0.05-P〈0.01）。结论：体外p53基因转染联合X射线照射可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调,Bax、caspase-3表达上调,具有显著的肿瘤抑制作用。     

Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的测定Survivin特异小干扰RNA(siRNA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响。方法构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株。用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRNA表达载体。Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降。MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P<0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P<0.01)。结论Survivin特异siRNA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡。     

Bax基因过表达与A549细胞凋亡的关系

目的 研究bcl-2基因家族促凋亡蛋白Bax在细胞凋亡中的作用，同时评价它作为肿瘤治疗潜在靶基因的可能性。方法 采用一种可诱导性表达的MT-Ⅱ调节系统，在外加锌离子(ZnSO4，100μmol／L)的条件下诱导目的基因表达。快速生长的A549细胞系作为靶细胞，获得表达Bax基因的稳定转染子。结果 Bax基因过表达的细胞显示广泛的细胞死亡。TUNEL实验证实细胞核的碎片化，从而提示这种细胞死亡是凋亡。流式细胞仪显示在诱导后24h，有14．68％的细胞发生凋亡。结论 结果表明这个表达系统能够在体外评价Bax基因的抗肿瘤效果；Bax基因能够诱导A549细胞发生凋亡。因此，Bax基因可能成为肿瘤基因治疗的靶基因。     

卵巢黏液性肿瘤caspase-3、caspase-9和Smac的表达及其意义

目的 探讨凋亡调控因子caspase-3、caspase-9和Smac在卵巢黏液性肿瘤中发生、发展过程中的作用。方法 采用免疫组化（SP法）和图像分析技术检测41例卵巢黏液性囊腺瘤、10例卵巢交界性黏液性囊腺瘤、14例卵巢黏液性囊腺癌和24例正常卵巢组织中Smac、caspase-9和caspase-3的表达水平。结果 caspase-3、caspase-9和Smac在41例黏液性囊腺瘤中的表达率分别为93%、93%和73.3%;在10例交界性黏液性囊腺瘤中的表达率分别为70%、80%和80%;在14例黏液性囊腺癌中的表达率分别为96%、96%和84%。阳性信号主要定位于细胞质,呈弥漫分布。而在正常卵巢中24例中的表达率分别为83.3%、80.9%和58.3%。caspase-3、caspase-9和Smac在黏液性卵巢肿瘤中的表达增加（P〈0.05）。结论 caspase-3、caspase-9和Smac可能会成为卵巢黏液性肿瘤治疗的新靶点。     

荧光内参在校正Caspase-3/7活性检测偏差中的应用

目的 改进Caspase-3/7活性检测方法.方法 在顺铂诱导的HeLa细胞凋亡模型中,分别利用传统的和改良的实验方法检测Caspase-3/7的活性变化,并与Western印迹实验结果进行方法学比较.结果 改良的实验方法显示不同剂量顺铂诱导下,HeLa细胞Caspase-3/7活性有剂量依赖性增高,与Western印迹实验结果相一致,但传统实验方法显示HeLa细胞Caspase-3/7活性呈现先增高后降低的趋势.结论 由于参测细胞数不同,导致这种Caspase-3/7活性检测方法不能真实反映细胞凋亡程度.本研究成功建立了一种新的改良型Caspase-3/7活性检测方式,这种检测方法可以排除不同凋亡诱导方式诱导细胞凋亡时所产生的因参测细胞数不同所造成的Caspase-3/7活性检测的误差.     

LHRH-PE40对非小细胞肺癌细胞A549的作用

目的研究促黄体激素释放激素(LHRH)基因与绿脓杆菌外毒素A(PE40)基因重组蛋白(LHRH-PE40)对非小细胞肺癌细胞A549的毒性作用。方法从用扫描电镜观察LHRH-PE40对A549细胞产生的细胞毒性作用,用流式细胞仪检测LHRH-PE40对A549细胞周期的影响。结果扫描电镜观察可见LHRH-PE40对A549细胞产生的毒性作用使A549细胞表面凸凹不平,流式细胞仪检测发现LHRH-PE40使A549细胞出现明显的凋亡。结论 LHRH-PE40可以诱导A549细胞凋亡。     

乳腺癌中caspase-3和caspase-9的表达及其意义

目的探讨caspase-3和caspase-9在乳腺癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SP法和原位杂交(ISH)技术检测80例乳腺浸润性导管癌(invasive duct carcinoma,IDC)、23例导管内癌(ductal carcinoma in situ,DCIS)、37例增生症和9例癌旁组织中caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白的表达。结果 caspase-3 mRNA在各组中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。caspase-3蛋白在IDC、DCIS、增生症中的表达均高于癌旁组织(P<0.05),在IDC、DCIS中的表达均高于增生症组(P<0.05)。caspase-9 mRNA和蛋白在IDC、DCIS、增生症中的表达均低于癌旁组织(P<0.05),IDC、DCIS中的表达均低于增生症组(P<0.05)。caspase-3、caspase-9蛋白在IDC与DCIS中的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。caspase-3蛋白与mRNA在DCIS和增生症中的表达呈正相关(r=0.429,r=0.563,P<0.05)。caspase-9 mRNA与蛋白在各组中的表达均存在相关性(r=0.94,r=0.414,r=0.391,r=0.827,P<0.05)。caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白的表达与肿瘤大小等临床病理参数无相关性(P>0.05)。结论 caspase-3和caspase-9均参与乳腺导管癌的发生、发展。caspase-9蛋白表达降低,而caspase-3表达增高在乳腺癌的发生、发展过程中较常见;caspase-9表达降低可能与乳腺组织恶性转化有关。     

微小RNA-622对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨微小RNA (miRNA)-622对非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响。方法 培养A549细胞,分为miRNA-622组和miRNA-622阴性对照组 (NC组),分别转染miRNA-622模拟物及miRNA-622阴性对照。使用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测miRNA-622组和NC组miRNA-622的表达水平,采用噻唑蓝实验检测两组细胞增殖能力,采用流式细胞学技术检测两组细胞凋亡率。结果 miRNA-622组和NC组细胞中miRNA-622的相对表达水平分别为0.993±0.058、0.631±0.053,OD值分别为0.631±0.049、0.922±0.058,细胞凋亡率分别为12.230%±0.176%、7.400%±0.208 %,miRNA-622组miRNA-622的相对表达水平和细胞凋亡率均高于NC组,而OD值低于NC组,差异均有统计学意义(t=23.650、17.710、3.822,P值均<0.01)。结论 miRNA-622可抑制A549细胞增殖,促进A549细胞凋亡。     

Caspase-3, TUNEL and ultrastructural studies of small follicles in adult human ovarian biopsies

BACKGROUND: The aim of this study was to investigate evidence for cell death by apoptosis in small unilaminar ovarian follicles of adult humans. METHODS: Cortical biopsies from 13 healthy donors were either frozen and protein extracted for western blots or fixed for immunohistochemistry (IH) to localize procaspase-3 and active-caspase-3, to detect DNA fragmentation in situ and undertake routine transmission electron microscopy (TEM). RESULTS: Blots identified the presence of the inactive pro-form of caspase-3, and IH localized this in all follicles studied. In contrast, the active form of caspase-3, a major effector of apoptosis, was only detected in large antral follicles that also had microscopic signs of atresia. Active caspase-3 was not detected in primordial (n = 87), primary (n = 8) or secondary follicles. The atretic follicles were also the only ovarian structures with positive evidence of DNA fragmentation after terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labelling (TUNEL) treatment. Confocal microscopy showed dual labelling for both active caspase-3 and TUNEL in individual granulosa cells in large atretic follicles, but no such labelling was evident in any other follicles. No apoptotic bodies were seen by TEM in sections of 39 small follicles from seven patients. CONCLUSION: This study found evidence for TUNEL and active caspase-3 only in human ovarian antral follicles.     

膀胱移行细胞癌中fhit基因和survivin基因的表达和意义

目的探讨fhit基因和survivin基因在膀胱移行细胞癌中的表达和意义。方法用免疫组化S-P法检测62例膀胱移行细胞癌组织及10例正常膀胱粘膜组织中fhit蛋白和survivin蛋白的表达。结果10例正常膀胱粘膜组织中fhit蛋白表达均为阳性，survivin蛋白表达均为阴性；fhit蛋白在膀胱移行细胞癌中阳性表达率为46．77％（29／62），肿瘤不同分级中随恶性程度的增长表达减少，Ⅰ级与Ⅲ级比较，差异有统计学意义（P〈0．05），不同临床分期中随分期的增长表达减少，Tis～T1与T2～T4比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；survivin蛋白在膀胱移行细胞癌中阳性表达率为56．5％（35／62），肿瘤不同分级中随恶性程度的增高表达增高（P〈0．05），不同临床分期中随分期的增长表达增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；fhit蛋白和survivin蛋白表达相关（P〈0．05）。结论Fhit基因和survivin基因在膀胱移行细胞癌的发生、发展过程中起着重要的作用。Fhit基因可能通过肿瘤凋亡抑制途径发挥作用的。     

环状RNA circ0004771对肺腺癌细胞A549的增殖、迁移与侵袭的影响

目的 探讨环状RNA circ0004771对肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响及其机制。方法 培养肺腺癌A549细胞,分为阴性对照（si-NC）组及circ0004771小干扰RNA（siRNA）组（si-circ0004771组）,将si-NC和circ0004771 siRNA分别转染入相应组A549细胞中。si-NC组和si-circ0004771组细胞转染后,通过实时荧光定量聚合酶链反应检测2组细胞circ0004771、miR-339-5p的表达水平,通过细胞计数试剂盒法检测细胞活力,通过EdU实验检测2组细胞增殖能力,通过Transwell小室实验检测2组细胞迁移和侵袭能力。结果 si-NC组和si-circ0004771组A549细胞circ0004771基因的相对表达水平分别为3.07±0.07和0.68±0.04,miR-339-5p相对表达水平分别为1.14±0.13和2.33±0.07,差异均有统计学意义（t=51.34、13.96,P值均<0.001）。si-NC组和si-circ0004771组A549细胞在培养前（0 h）和培养后24、48 h的吸光度值分别为0.21±0.02、0.35±0.05、0.65±0.04和0.21±0.01、0.33±0.04、0.59±0.05,差异均无统计学意义（P值均>0.05）;而在培养后72 h si-circ0004771组吸光度为0.92±0.15, 小于si-NC组的1.32±0.04,差异有统计学意义（t=4.46,P=0.011）。EdU实验中,si-circ0004771组细胞阳性率为47.97%±4.68%,低于si-NC组的58.61%±2.15%,差异有统计学意义（t=3.58,P=0.023）。转染后si-circ0004771组的细胞迁移率、侵袭率分别为52.27%±2.92%、55.33%±6.29%,均低于si-NC组的99.79%±4.23%、98.67%±5.72%,差异均有统计学意义（t=16.26、8.83,P值均<0.001）。结论 下调肺腺癌A549细胞circ0004771的表达水平,可以降低A549细胞的活力和增殖能力,可抑制A549细胞的迁移、侵袭能力,其作用机制可能与上调miR-339-5p的表达有关。