真核表达载体pEGFP-claudin-1的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中进行表达.方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增claudin-1开放读码框(ORF)基因,将其插入到pEGFP-C3载体的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,酶切鉴定并测序.通过脂质体法转染293T细胞,进行荧光检测和Western blot分析.结果:构建了含有claudin-1 ORF的真核表达质粒pEGFP-claudin-1,转染293T细胞后,经荧光可见细胞膜有EGFP-claudin-1 融合蛋白的表达,Western blot检测发现有相对分子质量(Mr)49 000的蛋白条带.结论:成功地构建真核表达载体pEGFP-claudin-1,并在293T细胞中表达,为研究claudin-1的功能奠定了基础.     

人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.     

小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的:克隆酪氨酸酶基因(TYR), 并在毕赤酵母中表达和纯化其融合蛋白, 体外测定纯化的TYR活性.方法:利用RT-PCR技术, 从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆全长TYR, 克隆至pMD18-T载体, 进行双链核苷酸序列测定.构建TYR毕赤酵母表达质粒pPICZaA- TYR并导入毕赤酵母Pichia pastoris GS115, 表达的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot进行分析, 采用Co2 离子亲和层析柱纯化TYR并采用TYR多巴速率氧化法体外测定纯化的TYR活性.结果:克隆了TYR基因.构建了重组表达质粒pPICZaA-TYR.SDS-PAGE和Western blot分析显示, 在相对分子质量(Mr)为约53 000处出现1条特异性蛋白带, 且能与兔抗TYR抗体发生反应.结论:克隆TYR基因片段与基因库所登录的序列相一致, 并在毕赤酵母中获得表达和纯化并在体外测定了纯化的TYR活性.     

人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSeetag2/seFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达.方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体psectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况.结果:将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv.将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000.结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据.     

syk真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响

目的:构建非受体蛋白酪氨酸激酶Syk的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞,使其在细胞中稳定表达,以研究Syk对人乳腺癌细胞MHC-Ⅰ类分子表达的影响.方法:以RTPCR法从人乳腺癌细胞株MDA-MB-468扩增出syk编码序列基因片段,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中.对重组质粒进行酶切、PCR及测序鉴定后,以脂质体介导法转染Syk缺失的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,经G418筛选,构建syk基因稳定表达的细胞株,通过Western blot、RT-PCR和流式细胞术检测转染乳腺癌细胞Syk、MHC-Ⅰ及ICAM-Ⅰ的表达.结果:构建了hsyk真核表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/hsyk,并在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中获得稳定表达.表达Syk的MDA-MB-231细胞同时可以高表达MHC-Ⅰ和ICAM-Ⅰ.结论:成功地构建了syk真核表达载体并在真核细胞中表达,为进一步的肿瘤免疫研究奠定了实验基础.     

结合RNAi技术的三重表达HCV DNA疫苗的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达.方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH Ⅰ位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达.结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功.在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清.结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应.为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础.     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#在大肠杆菌中的可溶性表达

目的: 重组表达抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体(scFv)1956#, 提高scFv1956#的可溶性表达量.方法: 用PCR扩增含抗人AChR scFv1956#的载体pHEN1中的scFv1956#结构基因, 并将其插入到原核表达载体pET44a( ).用重新构建的载体转化E.coli BL21(DE3)pLysS, IPTG诱导表达.用SDS-PAGE来比较更换载体及不同温度和时间对可溶性表达量的影响, 并通过Western blot进行鉴定.结果: PCR产物大小为785 bp, 与预计相符; 所构建质粒经测序证实scFv1956# 核苷酸序列正确, 并正确插入载体pET44a( ).诱导后得到的可溶性表达量优于原载体pHEN1.结论: 载体pET44a( )表达的端融蛋白NusA可以帮助scFv1956# 的正确折叠, 从而获得大量可溶性表达.低温长时间诱导有助于提高可溶性表达的量.