恶性疟原虫MSP1-19毕氏酵母真核表达克隆的构建

目的 构建恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量1．9万片段（MSP1-19）毕氏酵母真核表达克隆。方法 利用PCR技术扩增出MSP1-19，插入pPIC9载体中，鉴定正确的MSP1-19基因，插入毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9k中，DNA测序鉴定序列的正确性，转化酵母细胞。结果 筛选出的阳性克隆为MSP1-19表达克隆。结论 用分子生物学方法重组构建的MSP1-19毕氏酵母真核表达克隆，为高效表达MSP1-19及其活性鉴定奠定了基础。     

人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建

目的构建人血管内皮抑素（ES）毕赤酵母真核表达载体。方法利用RT—PCR技术从人体肝脏组织扩增出ES基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,酶切鉴定并进行DNA测序鉴定。结果成功克隆ES基因并筛选出pPIC9载体中的ES阳性克隆,测序证实其序列与已报道的ES基因序列一致。结论用分子生物学方法构建ES毕赤酵母真核表达载体的成功,使高效表达ES蛋白成为可能。     

家兔C型利钠肽基因真核表达载体的构建及鉴定

目的为开展C型利钠肽(CNP)基因治疗构建家兔CNP基因真核表达载体。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆CNP基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD 18-T中,用PstⅠ单酶切筛选出负向插入片段,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,然后用双酶切、DNA序列测定鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果酶切及测序鉴定证实,家兔CNP基因全长编码区被准确插入到pEGFP-N1酶切位点HindⅢ和KpnⅠ中。结论含家兔CNP基因真核表达载体的成功构建和鉴定为CNP基因治疗的研究奠定了基础。     

分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲalpha真核反义表达载体及鉴定

目的应用分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲ alpha (hTOP 3 alpha)真核反义表达载体,为进一步阐明其与控制细胞周期的相关基因ATM之间的相互作用,研究ATM的生物学功能奠定基础.方法采用分步克隆法首先用 Hind Ⅲ和EcoRI双酶切构建插入2.6 kb的片段,再用EcoRI酶切插入另一1 kb的片段,最终获得人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达的重组载体.结果经酶切、测序鉴定,人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达载体构建成功.结论为研究ATM基因与人拓扑异构酶Ⅲ的相互作用,阐明其生物学功能奠定了基础,同时为大片段的基因的表达载体构建探索了新的方法和途径.     

蜂毒肽表达克隆的初步构建

（1）目的 构建重组蜂毒肽的原核表达克隆。（2）方法 人工合成含特异性酶切位点的A,B两条寡核苷酸片段,在Klenow酶作用下形成目的基因,用限制性内切酶HindⅢ,XmnI同时酶切目的基因和表达载体Pmal-p2质粒,在T4连接酶的作用下构建两者的重组体,通过α-互补筛选出阳性克隆,并通过特异性酶切和测序分析进行鉴定。（3）结果 筛选出的阳性克隆为重组的蜂毒肽表达克隆。（4）结论 用分子生物学的方法重组构建的蜂毒肽基因表达克隆,是蜂毒肽蛋白表达及活性鉴定的基础。     

分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲalph真核反义表达载体及鉴定

目的 应用分步克隆法构建人拓扑异构酶Ⅲ alpha(hTOP 3 alpha)真核反义表达载体，为进一步阐明其与控制细胞周期的相关基因ATM之间的相互作用，研究ATM的生物学功能奠定基础。方法 采用分步克隆法首先用Hind Ⅲ和EcoRI双酶切构建插入2．6kb的片段，再用EcoRI酶切插入另一1kb的片段，最终获得人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达的重组载体。结果 经酶切、测序鉴定，人拓扑异构酶Ⅲ真核反义表达载体构建成功。结论 为研究ATM基因与人拓扑异构酶Ⅲ的相互作用，阐明其生物学功能奠定了基础，同时为大片段的基因的表达载体构建探索了新的方法和途径。     

人C型利钠肽基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：为开展C型利钠肽基因治疗，克隆人C型利钠肽基因并构建其真核表达载体。方法：通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆人C型利钠肽基因全长编码区，将该DNA片段亚克隆至克隆载体pBS-T中，用SmaⅠ单酶切筛选出负向插入片段，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，然后用双酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，人C型利钠肽基因全长编码区被准确插入至pcDNA3．1（＋）酶切位点HindⅢ和BamHⅠ之间，并且未发现有碱基突变或移位。结论：含人C型利钠肽基因真核表达质粒的成功构建并鉴定，为开展C型利钠肽基因治疗奠定了物质基础。     

RON基因反义核酸真核表达载体的构建策略

目的 构建RON基因跨膜区段(RONm)的反义核酸真核表达载体。方法 用RT-PCR技术，从人肺癌细胞提取的总RNA克隆RONm eDNA序列。然后酶切鉴定与测序分析得到RONm的T载体，再将RONm反向插入peDNA3．1 中，酶切鉴定得到RONm反义真核表达载体。结果 用RT-PCR亚克隆RONm，测序结果与GenBank的RONm相应序列(X70040)一致，阅读框无改变。构建出正确的RONm反义真核表达载体。结论 成功构建RONm反义核酸真核表达载体，为进一步将RON基因反义核酸作为一种肺癌基因治疗方法的研究打下了分子生物学基础。     

抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的 构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT。方法 用限制性内切酶EcoRⅠ酶切抑癌基因FHIT的克隆载体pGEM-FHIT获得FHIT基因片段,长度为0.9kb,将其插入真核表达载体pHCMVsp1A CMV启动子的下游,用HindⅢ酶切鉴定FHIT基因插入方向。结果 PCR扩增及EcoRⅠ、HindⅢ酶切鉴定证实FHIT基因以正确方向插入表达质粒pHCMV1A中。结论 成功构建抑癌基因FHIT真核表达质粒pHCMVsp1A-FHIT,为研究FHIT的抑癌作用提供有效的分子工具。     

乙型肝炎病毒X基因cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的为研究HBVX基因（HBx）与原发性肝细胞癌发生的关系，克隆HBx的cDNA并构建HBx真核表达载体。方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法从HepG2．2．15细胞中扩增出HBx的cDNA，克隆到质粒PCDNA3．1中。结果RT—PCR扩增出约460bp片段，经酶切鉴定显示HBx的cDNA真核表达载体（HBx—PCDNA3．1）构建成功，测序结果显示HBx的cDNA与已发表的的序列相同。结论成功地构建了HBx的真核表达载体HBx—PCDNA3．1。     

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体的克隆及鉴定

目的构建人HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体。方法经重组PCR将HLA-G5和IgGFc基因拼接并插入T载体。鉴定后,双酶切得到融合基因并插入真核表达载体pcDNA3.1。结果PCR、限制性内切酶酶切和序列分析表明已构建pcDNA3.1-HLA-G5表达载体。结论成功构建了HLA-G5-IgGFc段融合蛋白真核表达载体。     

Tre 酶真核表达载体构建及其特异性识别 loxLTR序列的功能鉴定

目的：清除人类免疫缺陷病毒（ human immunodeficiency virus , HIV）前病毒是治愈艾滋病的关键。构建Tre酶真核表达载体,鉴定其特异性识别HIV前病毒中所含有的loxLTR序列功能。方法经基因合成、PCR、酶切、连接等基因重组技术将Tre基因插入pcDNA3．1真核表达载体中,将EGFPpA-LoxLTR序列插入pmCherry-N1载体中,并经酶切、PCR、测序鉴定;用电穿孔法将构建的载体转染到HeLa细胞,用荧光显微镜观察荧光强弱及变化。结果经PCR、酶切、电泳、测序分析鉴定,Tre酶真核表达载体构建正确,转染HeLa细胞后,能特异性识别并剪切loxLTR序列。结论构建的Tre酶真核表达载体可在HeLa细胞中表达,并特异性识别loxLTR序列。     

肝素酶反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建肝素酶（heparanase，Hpa）反义RNA真核表达载体。方法 提取胃癌组织总RNA，按照GenBank中检索出的Hpa基因cDNA序列，设计并合成反义Hpa基因片段的引物，进行RT-PCR，并将扩增产物克隆至DGEMT载体，PCR鉴定及测序证实后，双酶切pGEM-T-antiHpa重组体回收目的片段，再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果 PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的Hpa反义RNA表达质粒pcDNA3．1-antiHpa，分别作PCR及双酶切（BamHⅠ和HindⅢ）鉴定，证实其中有目的片段完整插入，插入片段测序结果与反义Hpa序列设计完全一致。结论 成功构建了Hpa反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-antiHpa，此结果为进一步研究Hpa蛋白分子的生物学功能和以Hpa为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测

目的：构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体，并在真核生物毕氏酵母细胞中表达。方法：用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后，克隆到毕氏酵母载体PICZαA中，构建重组表达质粒pPICαA—LMP2A。pICZαA—LMP2A经SAC Ⅰ酶切线性化，采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GS115，经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株，用PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS—PAGE电泳和westem—b10tting分析。结果：重组质粒pPICZαA—LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性。SDS—PAGE电泳和west-em-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54Kda，与预计值相同。结论：构建了LMP2A毕氏酵母表达载体，并在酵母细胞中成功表达。     

DNA甲基转移酶3b催化区保守序列shRNA真核表达载体构建

目的构建针对基因DNA甲基转移酶3bmRNA催化区保守序列的shRNA真核表达载体,并对其克隆进行鉴定。方法以DNMT3bmRNA序列为靶基因设计3条shRNA和一条阴性对照HK,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体PGensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT3b-shRNA1、P-DNMT3b-shRNA2、P-DNMT3b-shRNA3、P-HK。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,接种于LB平板后分别挑取5个单克隆菌落进行扩增,经筛选后对提取质粒进行测序鉴定。结果重组质粒经SalI酶切鉴定得到大小2个基因片段,大片段约为4．55kb,小片段约为440bp,与设计相同;四组重组质粒经测序鉴定显示插入完全正确。结论成功构建了P-DNMT3b-shRNA（1、2、3）及HK真核表达载体,为下一步实验奠定了基础。     

TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体.方法:提取胃癌组织总RNA,用TIMP-1基因引物进行RT-PCR,将扩增产物克隆至pGEM-T载体,PCR鉴定及测序证实后,BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pGEM-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C3中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析.结果:构建的pEGFP-C3-TIMP-1表达载体分别作PCR及双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与TIMP-1序列设计完全一致,将其转染人胃癌BGC-823细胞后,TIMP-1的表达定位在细胞胞浆内.结论:成功构建了TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体,为TIMP-1的肿瘤靶向治疗研究奠定了基础.