外源性Rb基因对U937细胞泡沫化过程中CD36表达的影响

为研究抑癌基因Rb基因在U937细胞泡沫化过程中的表达，应用重组腺病毒载体导入外源性Rb基因。采用逆转录聚合酶链反应和流式细胞术检测氧化型低密度脂蛋白致U937细胞泡沫化过程中清道夫受体CD36和Rb基因的表达和外源性Rb基因导入U937细胞后CD36和Rb基因的表达。结果发现，氧化型低密度脂蛋白致U937细胞泡沫化过程中，Rb mRNA和蛋白的表达随作用时间延长呈下调趋势，CD36 mRNA和蛋白的表达则呈上调趋势；随着外源性Rb导入U937细胞并表达，CD36表达呈下调趋势。结果提示，外源性Rb基因的导入可以下调清道夫受体CD36的表达。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时细胞间粘附分子-1的表达时序

研究氧化型低密度脂蛋白诱导人单核细胞U937细胞吞噬脂质发生凋亡过程中对细胞间粘附分子－1表达的影响,用胸腺嘧啶核苷将U937细胞阻滞在G1期,流式细胞仪监测同步化处理效果;流式细胞术检测U937细胞泡沫化过程中细胞凋亡和细胞间粘附分子－1的表达;逆转录－聚合酶链反应分析细胞间粘附分子－1 mRNA的表达,结果显示,80mg/L氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞48h可形成典型的泡沫细胞,72h可见凋亡细胞增多;氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞12h即可检测到细胞间粘附分子－1表达,24h时达到最高值,48h略有降低,72h时则明显降低。结果表明,氧化型低密度脂蛋白可以促进U937细胞细胞间粘附分子－1表达,细胞间粘附分子－1的表达增强有利于巨噬细胞的趋化运动和对脂质的吞噬。     

过氧化体增殖物激活型受体γ对巨噬细胞脂质蓄积及CD36表达的影响

目的观察过氧化体增殖物激活型受体γ激动剂和拮抗剂对THP-1巨噬细胞胆固醇蓄积及CD36表达的影响。方法实验分对照组、氧化型低密度脂蛋白组、Ciglitazone处理组和GW9662处理组,后两组用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白分别与过氧化体增殖物激活型受体γ激动剂Ciglitazone(10μmol/L)及拮抗剂GW9662(10μmol/L)共同孵育24 h,高效液相色谱分析法检测细胞总胆固醇蓄积情况,RT-PCR和Western blot分别检测THP-1巨噬细胞CD36 mRNA和蛋白的表达。结果与对照组(76.28±10.36 mg/g)相比,氧化型低密度脂蛋白(121.63±13.32 mg/g)能使细胞总胆固醇含量显著增加,而Ciglitazone能使氧化型低密度脂蛋白处理的细胞总胆固醇含量进一步增加(136.23±14.78 mg/g),GW9662能使氧化型低密度脂蛋白处理的细胞总胆固醇含量减少(98.52±11.45 mg/g)。过氧化体增殖物激活型受体γ拮抗剂GW9662使巨噬细胞CD36 mRNA和蛋白的表达下调及胆固醇蓄积减少,过氧化体增殖物激活型受体γ激动剂Ciglitazone使巨噬细胞CD36 mRNA和蛋白的表达上调及胆固醇蓄积增多。结论过氧化体增殖物激活型受体γ拮抗剂使THP-1巨噬细胞胆固醇蓄积减少及氧化型低密度脂蛋白诱导的CD36表达下调。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡及其对p53、p21和Bcl-2表达的影响

为研究单核细胞源性泡沫细胞凋亡机制 ,以氧化型低密度脂蛋白诱导人髓系白血病细胞U937凋亡 ,观察p5 3、p2 1和Bcl- 2的表达。用流式细胞术和DNA断裂分析检测细胞凋亡 ;用细胞免疫荧光标记结合流式细胞术检测p5 3、p2 1和Bcl- 2蛋白表达 ,反转录聚合酶链反应显示p5 3、p2 1和Bcl- 2mRNA表达水平。结果表明氧化型低密度脂蛋白可致U937细胞凋亡 ,其作用具有浓度效应 ;氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡过程中 ,p5 3、p2 1mRNA和蛋白表达增加 ,Bcl- 2mRNA和蛋白表达减少。提示氧化型低密度脂蛋白可能通过上调p5 3、p2 1基因表达 ,下调Bcl- 2基因 ,导致U937细胞凋亡。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡及其对p53、p21和Bcl-2表达的影响

为研究单核细胞源性泡沫细胞凋亡机制,以氧化型低密度脂蛋白诱导人髓系白血病细胞U937凋亡,观察p5 3、p2 1和Bcl- 2的表达。用流式细胞术和DNA断裂分析检测细胞凋亡;用细胞免疫荧光标记结合流式细胞术检测p5 3、p2 1和Bcl- 2蛋白表达,反转录聚合酶链反应显示p5 3、p2 1和Bcl- 2mRNA表达水平。结果表明氧化型低密度脂蛋白可致U937细胞凋亡,其作用具有浓度效应;氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡过程中,p5 3、p2 1mRNA和蛋白表达增加,Bcl- 2mRNA和蛋白表达减少。提示氧化型低密度脂蛋白可能通过上调p5 3、p2 1基因表达,下调Bcl- 2基因,导致U937细胞凋亡。     

氧化型低密度脂蛋白中不同氧化产物对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体胆固醇蓄积的影响

为研究氧化型低密度脂蛋白中不同氧化产物对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体胆固醇蓄积的影响。分别用1 0 0mg L的铜氧化的低密度脂蛋白和次氯酸钠氧化的低密度脂蛋白处理小鼠腹腔巨噬细胞 2 4h ,分别测定巨噬细胞溶酶体中胆固醇和总蛋白的含量以及溶酶体中组织蛋白酶L的活性。结果发现 ,铜氧化型低密度脂蛋白和次氯酸钠氧化型低密度脂蛋白均可引起总胆固醇和总蛋白在溶酶体蓄积 (实验组总胆固醇分别为 1 6 .90± 0 .1 5 μg和1 5 .1 1± 0 .5 4 μg ,对照组为 3.2 8± 0 .0 8μg ,P <0 .0 1 ;实验组总蛋白分别为 1 7.93± 1 .6 6 μg和 2 1 .0 0± 1 .6 8μg ,对照组为 1 3.39± 2 .6 4 μg ,P <0 .0 1 )。但蓄积的胆固醇类型有所不同 ,前者以游离胆固醇为主 (游离胆固醇为 1 4 .1 3± 0 .1 4μg ,胆固醇酯为 4 .77± 0 .33μg) ;后者则以胆固醇酯为主 (游离胆固醇为 5 .0 1± 0 .30 μg ,胆固醇酯为 1 0 .1 0± 0 .4 8μg)。铜氧化低密度脂蛋白可造成溶酶体组织蛋白酶L活性明显下降 (1 1 .1± 2 .3kau g比 73.2± 1 5 .0kau g ,P <0 .0 1 ) ,而次氯酸钠氧化低密度脂蛋白的作用不明显 (73.6± 9.5比 73.2± 1 5 .0 ,P >0 .0 5 )。以上结果提示 ,不同氧化产物引起溶酶体胆固醇蓄积的种类不同 ,而蛋白降解受阻可     

氧化型低密度脂蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇蓄积的影响及可能机制

研究氧化型低密度脂蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞胆固醇蓄积的影响 ,并探讨其与组织蛋白酶活性之间的关系。用 10 0mg/L的乙酰化低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白处理小鼠腹腔巨噬细胞 2 4h ,分别测定巨噬细胞胞浆和溶酶体中胆固醇的含量以及溶酶体中组织蛋白酶的活性。结果发现 ,乙酰化低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白均可引起细胞胆固醇含量增加 (分别为 2 2 .2± 0 .4 μg和 2 2 .5 5± 0 .15 μg比对照组的 7.0± 0 .4 μg ,P <0 .0 1) ,但蓄积部位和形式完全不同 ,前者蓄积部位主要在胞浆并以胆固醇酯为主 (胞浆与溶酶体分别为 18.9± 0 .4 μg和3.3± 0 .2 μg ,游离胆固醇与胆固醇酯分别为 0 .73± 0 .0 5 μg和 18.1± 0 .4 μg) ,后者主要在溶酶体并以游离胆固醇为主 (胞浆与溶酶体分别为 3.6 5± 0 .14 μg和 18.90± 0 .15 μg ,游离胆固醇与胆固醇酯分别为 14 .13± 0 .14 μg和 4 .77±0 .33μg) ;前者不引起溶酶体组织蛋白酶的活性改变和蛋白含量增加 (组织蛋白酶L和D分别为 99.5± 3.4和 2 8.0± 2 .4 ,对照组分别为 10 2 .3± 8.2和 2 7.3± 1.6 ,P >0 .0 5 ;蛋白含量为 8.8± 0 .4 μg ,对照组为 9.0± 0 .3μg,P >0 .0 5 ) ;后者则造成溶酶体组织蛋白酶活性的明显降低和蛋白蓄积 (组织     

阿托伐他汀对THP-1巨噬细胞脂质蓄积及CD36表达的影响

目的观察阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白诱导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积及CD36表达的影响。方法用50mg/L氧化型低密度脂蛋白与不同浓度的阿托伐他汀(0、0.312、1.25和5μmol/L)共同孵育THP-1巨噬细胞24h,以空白组作对照,用液体闪烁计数法检测细胞[3H]胆固醇流入情况,油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,高效液相色谱分析法检测细胞内总胆固醇水平,逆转录聚合酶链反应与免疫印迹分析法分别检测THP-1巨噬细胞CD36mRNA和蛋白的表达。结果阿托伐他汀使THP-1巨噬细胞胆固醇流入减少,对照组胆固醇流入为35.90%±2.36%,0、0.312、1.25和5μmol/L阿托伐他汀组胆固醇流入分别为47.10%±3.18%、41.20%±2.88%、35.10%±2.35%和28.30%±1.98%;阿托伐他汀能抑制THP-1巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白的摄取,油红O染色可见氧化型低密度脂蛋白 阿托伐他汀组细胞内脂滴较氧化型低密度脂蛋白组明显减少,且脂滴颗粒体积变小;高效液相色谱分析发现,对照组细胞总胆固醇含量为78.24±11.35mg/g,0、0.312、1.25和5μmol/L阿托伐他汀组细胞总胆固醇含量分别为123.13±15.92mg/g、115.36±13.18mg/g、107.52±12.05mg/g和98.03±10.24mg/g。阿托伐他汀使氧化型低密度脂蛋白诱导的THP-1巨噬细胞CD36mRNA和蛋白的表达下调。结论阿托伐他汀引起氧化型低密度脂蛋白诱导的THP-1巨噬细胞CD36表达下调,并使脂质蓄积减少。     

氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡时泛素缀合酶和p53的表达

为研究氧化型低密度脂蛋白致U937细胞凋亡时泛素-蛋白酶体通路中泛素缀合酶、p53与泡沫细胞凋亡之间的关系，用氧化型低密度脂蛋白处理人单核细胞U937细胞，诱导其凋亡，采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测细胞凋亡，逆转录聚合酶链反应检测泛素缀合酶和p53的基因表达；流式细胞术分析泛素缀合酶、载脂蛋白B和P153的蛋白表达。结果发现，氧化型低密度脂蛋白可以诱导U937细胞凋亡，在U937细胞凋亡过程中泛素缀合酶表达降低，p53表达增高，而且细胞内载脂蛋白B也增加。结果提示，泛素缀合酶的表达降低可能使P53和栽脂蛋白B经泛素-蛋白酶体通路的降解减慢．从而引起P53和载脂蛋白B在细胞内积聚．导致U937细胞凋亡。     

高效液相色谱分析氧化型低密度脂蛋白处理的U937细胞胞内胆固醇及胆固醇酯

为找到一种判断泡沫细胞与非泡沫细胞的简便而较为实用的方法，本文采用正己烷-异丙醇从U937单核细胞内提取胆固醇，并用醇溶性氢氧化钾除去其中的甘油三酯成分，用三氯乙酸去其中的蛋白成分。以异丙醇：正己烷：乙腈为溶剂洗脱系统，采用疏水性较弱的核酸分离柱，进行高效液相色谱分析，分离纯化胆固醇和胆固醇酯成分，并采用L－B（LiebermanBurchard）显色法结合波谱分析法对所胆固醇峰进行鉴定。结果表明胆固醇含量在0．05～1g／L之间与其峰面积有较好的线性关系，其最低检出量为4mg／g细胞蛋白（100mg细胞蛋白相当于1×108个细胞），通过定性与定量分析，结果表明，U937单核细胞株经氧化型低密度脂蛋白处理48h后，其胞内的胆固醇酯占胞内总胆固醇60％以上。     

CD36介导氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞泡沫化和凋亡

为探讨清道夫受体ＣＤ３６在氧化型低密度脂蛋白诱导Ｕ９３７细胞泡沫化和凋亡中的作用,用氧化型低密度脂蛋白温育Ｕ９３７细胞,观察Ｕ９３７细胞泡沫化过程中ＣＤ３６的表达时序和泡沫细胞的凋亡;用ＣＤ３６单克隆抗体阻断Ｕ９３７细胞的吞噬作用,观察Ｕ９３７细胞吞噬蓄积胆固醇和细胞凋亡的改变。细胞胆固醇以修饰的酶荧光法测定;用流式细胞术检测异硫氰酸荧光素－抗ＣＤ３６单克隆抗体特异标记的ＣＤ３６和细胞的凋亡情况;用逆转录聚合酶链反应检测ＣＤ３６ｍＲＮＡ的表达。结果发现,８０ｍｇ／Ｌ氧化型低密度脂蛋白与Ｕ９３７细胞温育２４ｈ可增加细胞内总胆固醇,４８ｈ时可形成典型的泡沫细胞;ＣＤ３６表达呈现时序性改变,６ｈ即可检出ＣＤ３６表达增高,２４ｈ达到最高值,４８ｈ表达略有降低,ＣＤ３６ｍＲＮＡ的转录与ＣＤ３６的表达一致。用２００ｍｇ／Ｌ     

U937泡沫细胞模型的建立

为建立一个新的人单核细胞来源的泡沫细胞模型,将Ｕ９３７细胞与８０ｍｇ／Ｌ氧化型低密度脂蛋白孵育４８ｈ,应用高效液相色谱检测发现细胞内胆固醇和胆固醇酯增加,胆固醇脂含量大于总胆固醇含量的５０％,应用光镜和透射电镜观察发现细胞乐内出现大量的红染颗粒或脂质空泡,提示Ｕ９３７细胞与８０ｍｇ／Ｌ氧化型低密度脂蛋白孵育４８ｈ后,成功建立了人类单核细胞源性泡沫细胞。     

氧化型低密度脂蛋白诱导猪主动脉平滑肌细胞凋亡

为了探讨氧化型低密度脂蛋白是否引起血管平滑肌细胞凋亡 ,把体外培养的猪主动脉平滑肌细胞与 15mg/L的氧化型低密度脂蛋白孵育 72h ,分别使用荧光染色技术和激光共聚焦显微技术观察细胞核的变化 ,应用流式细胞仪鉴别凋亡细胞。结果发现 ,15mg/L的氧化型低密度脂蛋白作用 72h后 ,荧光显微镜下可见染色质高度凝集 ,有核碎裂现象 ;激光共聚焦显微镜下见染色质固缩 ,核变小 ;流式细胞术鉴别为凋亡细胞。此结果提示 ,氧化型低密度脂蛋白能诱导血管平滑肌细胞发生凋亡 ,有典型的形态学改变。     

U937源性泡沫细胞形成中组织因子途径抑制物2的表达定位及变化规律

目的研究U937源性泡沫细胞形成过程中组织因子途径抑制物2的表达定位及变化规律。方法采用沉淀法提取人血浆低密度脂蛋白,硫酸铜氧化制备氧化型低密度脂蛋白,与U937单核细胞共同孵育,建立泡沫细胞模型,同时体外培养人脐静脉内皮细胞,加入U937泡沫细胞中共同培养,观察内皮细胞对泡沫细胞形成的影响。采用双重细胞免疫荧光定位组织因子途径抑制物2蛋白,时间免疫分辨荧光定量组织因子途径抑制物2蛋白,逆转录聚合酶链反应和荧光定量聚合酶链反应检测泡沫细胞内组织因子途径抑制物2基因的动态变化。结果组织因子途径抑制物2主要定位于U937单核细胞胞质中,与组织因子有相似的分布。氧化型低密度脂蛋白作用于U937细胞6h后组织因子途径抑制物2蛋白和基因表达水平持续增高,6h达至峰值而后表达持续降低。氧化型低密度脂蛋白作用于人脐静脉内皮细胞后组织因子途径抑制物2蛋白表达增加,24h时达至峰值。加入内皮细胞可改善氧化型低密度脂蛋白抑制U937细胞表达组织因子途径抑制物2的作用。结论U937泡沫细胞形成过程中,体外培养的人源性单核细株胞U937上存在组织因子途径抑制物2的表达抑制,而与人脐静脉内皮细胞共同培养可改善这种异常。     

丹参酮ⅡA对泡沫细胞胆固醇平衡的影响

目的通过体外细胞实验阐明丹参酮ⅡA对泡沫细胞胆固醇平衡的影响。方法体外培养小鼠RAW264.7细胞,以氧化型低密度脂蛋白诱导为泡沫细胞模型,并用不同浓度的丹参酮ⅡA进行处理,通过油红O染色观察细胞内脂质堆积情况,酶比色法定量检测细胞内总胆固醇和胆固醇酯的变化,荧光定量PCR和WesternBlot检测细胞中CD36、三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)、肝脏X受体α(LXRα)、过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)及PPARγ的mRNA和蛋白表达。结果 0～20 mg/L的丹参酮ⅡA对泡沫细胞增殖活力无明显影响,20 mg/L丹参酮ⅡA干预后,泡沫细胞内胆固醇酯与总胆固醇的比值显著降低,细胞内脂质累积减少,并上调AB-CA1、LXRα和PPARα的mRNA和蛋白表达,但对CD36表达无明显作用。结论丹参酮ⅡA能抑制泡沫细胞的形成,其机制可能是通过诱导PPARα、LXRα和ABCA1表达,促进胆固醇的外排。     

Oxidized low density lipoprotein induces differentiation and adhesion of human monocytes and the monocytic cell line U937.

Hypercholesterolemia is a major risk factor for development of atherosclerosis. In experimental animals fed a high-cholesterol diet, monocytes adhere to the arterial endothelium and penetrate into the intima where they differentiate into macrophages and ingest lipids thus giving rise to fatty streaks, the earliest type of atherosclerotic plaque. Macrophages express few receptors for normal low density lipoprotein (LDL) but can take up oxidized LDL by way of a scavenger receptor. The present study was designed to investigate the possible role of oxidized LDL in recruitment of resident intimal macrophages. We found that oxidized LDL induced enhanced expression of major histocompatibility complex class II molecules on human monocytes and U937 cells, a well-established system for studies of monocytic differentiation. Oxidized LDL also induced enhanced expression of the surface antigen LeuM3 but caused decreased expression of CD4 antigen, a pattern compatible with expression of a more-differentiated macrophage-like phenotype. Oxidized LDL also initiated aggregation of monocytes and U937 cells and stimulated adhesion of U937 cells to cultured endothelial cells. The results indicate that oxidized LDL may contribute to development of atherosclerosis by inducing adhesion of monocytes to the arterial intima and by stimulating intimal monocytes to differentiate into resident macrophages.     

Identification of low density lipoprotein as a regulator of Fc receptor-mediated phagocytosis.

Optimal expression of the high-affinity Fc receptor for IgG (FcRI) by the human monocyte cell line U-937 requires the presence of low density lipoprotein (LDL), and neither cholesterol nor high density lipoprotein can provide the component necessary for optimal FcRI expression. Here we show that FcR-mediated phagocytosis also requires LDL. U-937 cells were cultured in medium containing interferon gamma and either fetal calf serum (FCS) or delipidated FCS (DLFCS). The phagocytosis of IgG-coated erythrocytes was measured by a colorimetric assay. U-937 cells cultured in DLFCS medium had less than 16% of the phagocytic activity of cells cultured in normal FCS medium. Phagocytosis of IgG-coated erythrocytes could be inhibited 85% by the addition of murine IgG2a myeloma protein (5 micrograms/ml). U-937 cells cultured in DLFCS medium supplemented with pure cholesterol in ethanol (10 micrograms/ml) had only 30% of the phagocytic activity of cells grown in FCS medium. Addition of very low density lipoprotein (0.2 mg of protein per ml) to DLFCS medium also failed to increase phagocytosis. However, the addition of LDL (0.2 mg of protein per ml) to DLFCS medium restored 90% of the phagocytic activity. Since neither pure cholesterol nor very low density lipoprotein restored normal phagocytic function to U-937 cells despite a normalization of cellular cholesterol content, the restoration of phagocytosis observed with LDL replacement cannot be explained by mere delivery of cholesterol by LDL. Thus, LDL is required for the expression of FcRI and FcR-mediated phagocytosis by U-937 cells and may be an important regulator of phagocytic activity of monocytes and macrophages in vivo.