基于哺乳动物细胞培养的流感疫苗生产

传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养,但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差,因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要.本文综述国内外采用哺乳动物细胞培养,重点是MDCK细胞,生产流感疫苗的研究以及临床应用现状.     

流感疫苗的研究进展

流感是我国每年秋冬季常见的呼吸道传染病。接种疫苗是防控流感最为有效的措施。目前,多种类型的流感疫苗正在研发之中或已上市,同时,流感疫苗规模化生产的基质也逐渐从鸡胚转为哺乳动物细胞。此文介绍了流感疫苗的研究进展以及疫苗生产基质的变迁。     

哺乳动物细胞培养的新型流感疫苗的安全性和免疫原性[英]

试验用疫苗为双价流感A/B裂解病毒颗粒疫苗,由在MDCK细胞克隆的细胞系传代的病毒制备而成,含A/得克萨斯/36/91(类HINI)和B/哈尔滨/7/94病毒株。对照疫苗为在鸡胚传代的裂解病毒颗粒,其病毒株与试验疫苗相同。接种对象为18～50岁健康成人志愿者。按随机、双育法进行试验。将接种对象分为两组,分别接种细胞培养和鸡胚传代的流感疫苗,在三角肌肌注流感疫苗0.5ml。在接种前后分别检测血凝抑制抗体。在接种后观察不良反应。     

流感病毒血凝素在多种系统中表达的研究进展

流感疫苗是预防流感病毒感染最有效的方法。传统灭活流感疫苗通过在鸡胚中培养病毒后经纯化获得。流感每年都会发生季节性流行,流感病毒高度多变的特性使生产有效疫苗成为一项挑战。为了克服流感疫苗生产对鸡胚的依赖,需要开发新的流感疫苗生产策略。由于血凝素是流感病毒主要表面抗原之一,重组血凝素亚单位疫苗为流感疫苗的生产提供了一个方案。本文将对流感病毒血凝素在大肠埃希菌、毕赤酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞多种系统中表达的研究进行综述。     

简讯

Astellas公司与UMN公司携手开发细胞培养的流感疫苗 [关键词]细胞培养的流感疫苗；杆状病毒表达载体；流感抗原 [中图分类号]R457．2 日本Astellas公司已与UMN制药公司签定一项合作协议，该协议准予Astellas公司拥有在日本对UMN公司两种细胞培养的流感疫苗产品UMN-0501和-0502的共同开发和专营权。按照协议，Astellas公司将领导相关开发项目，并承担所有开发费用，而UMN公司则负责生产和供应最终的商业化产品。     

美国当前的疫苗生产能力可应对流感大流行

美国密歇根大学Lash等的一项研究显示，如果在今后5年内美国发生流感大流行，则利用现有设施生产细胞培养疫苗是控制疫情的唯一办法。 现行流感疫苗用鸡胚培养法制备。此法比细胞培养法费时费力。美国用鸡胚培养法需6个月才能生产出2．5亿～3亿剂流感疫苗，而且细胞培养法，4个月就能生产6亿剂疫苗。     

细胞培养物作为生产流感疫苗的基质

流感一直是严重的全球性公共卫生问题,近一百年来曾发生过三次大流行。免疫接种是控制流感大流行的最有效措施。鉴于快速大量生产流感疫苗需用受精鸡蛋来培养病毒,因此迫切需要一种可在发生流行时快速、大批量生产疫苗的替代的细胞培养系统。1995年2月16日世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开了关于细胞培养物作为生产流感疫苗的基质的会议,讨论了几个实验室关于流感病毒在稳定细胞系中培养的研究结果,并对下一步工作提出了建议。     

检测流感疫苗中宿主细胞DNA残留量的地高辛标记探针杂交法的建立

目的  建立地高辛标记DNA探针杂交法,检测基于Madin-Darby犬肾（Madin-Darby canine kidney,MDCK）细胞生产的流感疫苗中宿主DNA的残留量。方法  提取MDCK细胞基因组DNA,制备地高辛标记探针。对地高辛标记DNA探针杂交法进行特异性、灵敏度及稳定性验证, 并用此法检测3批MDCK细胞流感疫苗中的DNA残留量。结果 MDCK细胞基因组DNA的质量浓度为33 ng/μl,260 nm与280 nm波长处的吸光度比值为1.9。制备的探针与非同源细胞DNA无杂交,最低检测限度为10 pg。探针在－70 ℃放置9个月后,检测灵敏度仍可达到10 pg。经检测,MDCK细胞流感疫苗成品中的DNA残留量＜10 ng。结论  建立的地高辛标记探针杂交法特异性强、灵敏度高、稳定好,并且操作简便,可用于MDCK细胞流感疫苗中DNA残留量的检测。     

实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用效果观察

目的分析研究实时荧光逆转录聚合酶链式反应RT-PCR和细胞培养法两种检测方法在流感病毒检测中的应用、及适合的领域。方法采集2014年10月至2015年3月国家级流感检测哨点医院抚顺市中心医院内科和儿科门诊病例咽拭子样本500份,同时采用实时荧光RT-PCR检测流感病毒核酸,以及采用MDCK进行阳性标本培养,分离流感病毒,比较两种方法的灵敏度以及差异性。结果在500份样本中,通过荧光RT-PCR检测阳性84份;通过MDCK细胞培养法阳性35份。二者之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论实施荧光RT-PCR在检测流感病毒时快速有效,更适合应急疫情的快速诊断。细胞培养法更适合核实疫情的实验室诊断,通过病毒抗原性和基因特性进行分析,是流感病原学检测的基础。     

欧盟批准磷酸阿米吡啶治疗LambertEaton肌无力综合征

日前,德国药政当局批准了Novartis公司开发的经细胞培养法生产的甲型H1N1流感疫苗Celtura,它是一种含有名为MF59的佐剂的灭活流感病毒疫苗,以预防由现行大流行甲型H1N1流感病毒引起的流感疾病。     

翡翠贻贝多糖抑制流感病毒在狗肾细胞中增殖的研究

目的 研究翡翠贻贝多糖对流感病毒在狗肾细胞(MDCK)中增殖的抑制作用.方法 采用血凝滴度测定研究翡翠贻贝多糖对MDCK细胞培养甲型流感病毒的抑制作用:通过联合用药试验研究翡翠贻贝多糖对利巴韦林抗流感病毒的协同效应.结果 翡翠贻贝多糖能显著降低MDCK细胞培养流感病毒的血凝滴度:翡翠贻贝多糖与利巴韦林联合使用时,能显著抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖并具有相加效应.结论 翡翠贻贝多糖能明显抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖,对利巴韦林抗流感病毒具有相加效应,具有开发成抗流感病毒生物制剂的前景.     

MDCK细胞基质与鸡胚基质单价流感疫苗在小鼠中诱导的免疫反应的比较研究

目的:比较鸡胚基质和细胞基质的H1N1单价流感疫苗在小鼠体内诱导的免疫反应的差异.方法:分别采用鸡胚基质和MDCK细胞基质H1N1流感疫苗注射C57BL/6小鼠,通过体外中和实验,胞内细胞因子染色及多细胞因子检测比较2种基质生产的单价流感疫苗诱导的体液及细胞免疫反应的差异.结果:体液免疫方面,细胞基质疫苗组血清滴度与鸡...     

流感疫苗病毒株在MDCK细胞中的培养条件

 目的   研究4价流感疫苗所用病毒株在MDCK细胞中的扩增条件。方法 在6孔细胞培养板中以不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）（0.100 0、0.010 0、0.001 0、0.000 1）和对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶（胰酶）浓度（0、2、4、8 μg/ml）进行病毒接种和扩增,感染后72 h收获细胞上清液,检测病毒血凝素效价,确定病毒最佳扩增条件。随后,在搅拌瓶中进行MDCK细胞微载体悬浮培养,研究不同起始细胞接种密度（1.5×10⁵、2.0×10⁵、3.0×10⁵ 个/ml）和微载体浓度（3、5、10 g/L）对MDCK细胞生长的影响,确定细胞最佳扩增条件。根据确定的最佳扩增条件,在搅拌瓶培养体系中扩增4种病毒。结果 6孔板中4种流感病毒的最佳接种条件分别是,A/Michigan/45/2015(H1N1) pdm09：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度2 μg/ml;A/Hongkong/4801/2014(H3N2)：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml;B/Brisbane/60/2008：MOI 0.001 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml;B/Phuket/3073/2013：MOI 0.010 0、TPCK-胰酶浓度4 μg/ml。在搅拌瓶中以3.0×10⁵ 个/ml初始细胞密度接种,3 g/L微载体浓度培养,MDCK细胞能够实现较好的扩增,最高密度可达2.1×10⁶ 个/ml;搅拌瓶悬浮培养,以最佳接种条件接种后,4种病毒的血凝素效价为：6.75~8.42log₂ 血凝素单位/50 μl。结论   通过摸索病毒接种最佳MOI、TPCK-胰酶浓度及优化MDCK细胞微载体悬浮培养条件,能够在MDCK细胞微载体悬浮培养体系中有效扩增4价流感疫苗用病毒株,为后期工艺放大研究奠定基础。     

Cell-based influenza vaccines: progress to date

Human vaccines against influenza have been available for almost 60 years and, until recently, were prepared almost entirely from viruses grown in the allantoic cavity of 9- to 11-day-old embryonated chicken eggs. Manufacture involving eggs is not sufficiently flexible to allow vaccine supplies to be rapidly expanded, especially in the face of an impending pandemic. Other problems may arise from the infections of progenitor flocks that adversely affect egg supplies, and from the manufacturing process itself, where breakdowns in sterility can occur from the occasional contamination of large batches of viral allantoic fluid. In addition, egg-grown viruses exhibit differences in antigenicity from viruses isolated in mammalian cell lines from clinical specimens. These concerns and the probable need for greatly expanded manufacturing capability in the future have been brought into focus in recent years by the limited spread of H5N1 avian influenza infections to humans in several Asian countries. Alternative approaches involving the use of accredited anchorage-dependent and -independent preparations of the African Green monkey kidney (Vero), Madin-Darby canine kidney (MDCK) and other cell lines have been pursued by several manufacturers in recent years. Yields comparable with those obtained in embryonated eggs have been achieved. These improvements have occurred in parallel with newer technologies that allow the growth of cells in newer synthetic media that do not contain animal serum, in order to allay the concerns of regulators about the potential for spread of transmissible spongiform encephalopathies.     

A conserved matrix epitope based DNA vaccine protects mice against influenza A virus challenge

DNA vaccination represents a unique strategy to overcome the limitations of immunization with conventional vaccines which is restricted by the high variability of influenza viruses. We evaluated the protective efficacy of a plasmid DNA (pDNA), encoding an evolutionarily conserved epitope of viral matrix protein, against the influenza A virus infection. It was found that the mice immunized via the intra-muscular route purely elicited cell mediated immune response to the pDNA, with enhanced level of Th1 cytokines viz. IL-12 and IFNγ production in the stimulated splenocyte supernatant. The cytotoxic T lymphocytes in the spleen of immunized mice significantly lysed the virus-infected MDCK cells. A significant decrease in virus replication was also observed in the lungs of immunized mice and 83% of the mice were protected against the lethal challenge of influenza A viruses. These findings suggest that the plasmid DNA expressing a single matrix epitope may serve as a promising vaccine candidate to provide effective immunity in the susceptible (mouse) population.     

HY2006对流感病毒抑制作用研究

目的:研究新药HY2006对流感病毒的抑制作用。方法:通过微量细胞病变抑制法观察HY2006对流感病毒在传代狗肾细胞(MDCK细胞)上所致细胞病变的抑制效应;采用鸡胚培养法观察HY2006对流感病毒的抑制作用。并与病毒唑进行比较。结果:HY2006和病毒唑在MDCK细胞上对流感病毒的半数有效浓度(IC50)分别为(271±24)和(405±35)mg.L-1,治疗指数(TI)分别为13.68±2.70和7.92±1.03;HY2006在鸡胚中对流感病毒的半数有效量(ED50)显著低于病毒唑(分别为(1.48±0.68)和(7.57±1.28)g.L-1)。结论:HY2006在MDCK细胞上和鸡胚中对流感病毒均有明显的抑制作用,并且其药效较病毒唑强。     

流感病毒细胞培养法的应用

目的在实践中应用并完善流感病毒分离培养的检验方法,获得流感毒株,为流感监测积累经验并奠定良好的基础。方法选择92份哨点医院送检标本进行流感荧光定量PCR检测,流感荧光定量PCR检测阳性的接种MDCK细胞,在MDCK细胞上培养和增殖流感病毒,根据细胞CPE程度确定收获病毒的时间,收获病毒后用血凝试验和血凝抑制试验进行鉴定。结果 92份标本中核酸检测阳性的28份,病毒培养阳性的12份,11份为B型毒株,1份为甲型流感毒株。结论取得良好的分离培养效果,该方法的掌握和应用为流感监测奠定了良好的基础。