恶性疟原虫子孢子和无性期红细胞结合蛋白(MAEBL)的鉴定、表达和功能研究

疟原虫入侵红细胞的途径是由疟原虫的种类及宿主红细胞表面的特定受体决定的 ,包括多个步骤 ,需要裂殖子表达的蛋白与宿主细胞膜蛋白间相互作用。红细胞结合蛋白 (EBP)家族在疟原虫结合至红细胞表面时起重要作用 ,恶性疟原虫 (P .falci parum ,P .f)EBP 1 75与主要红细胞糖蛋白———血型糖蛋白A唾液酸残基结合。尽管大多数野生株和实验室株P .f入侵红细胞是通过唾液酸来实现的 ,但仍有少数例外。提示粘附细胞的表面或顶端复合物内还有其它配体。在疟原虫基因组内有一些EBP同源物 ,如ΨEBA 1 6 5只转录不翻译 ,jese bl,pebl,baebl,eb…     

血型糖蛋白与恶性疟原虫裂殖体的结合

已知恶性疟原虫裂殖子对人红细胞唾液酸蛋白即MN血型糖蛋白(GPS)具有识别作用,裂殖子通过与它结合从而侵入红细胞。作者用二种方法对其结构作了研究,首先用胰蛋白酶将GPS进行消化,并将其碎片与分离出来的裂殖体混合,然后再观察后者对红细胞的入侵情况以了解是否具有抑制裂殖子入侵的作用。结果低浓度糖蛋白A或高浓度糖蛋白A、B和C的混合物可抑制入侵,单独糖     

从表达菌培养液中提取鼠疫菌重组F1抗原

目的从表达鼠疫耶尔森氏菌F1蛋白的诱导培养液中提取纯化重组F1并检测其免疫反应性。方法收集诱导培养后离心去除菌体的培养液,采用硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法提取F1蛋白,产物经镍离子金属螯合亲和层析纯化,免疫印迹(Western blot)鉴定其免疫反应性。结果硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法均能从培养液中提取到重组F1蛋白,产物经纯化后可与鼠疫疫苗株免疫兔血清和既往鼠疫患者血清发生特异性结合反应。结论该表达菌表达效能较高,在诱导培养液中存在大量具有免疫学活性的重组F1蛋白。     

人红细胞膜血型糖蛋白B对恶性疟原虫入侵红细胞的影响

在疟原虫入侵红细胞的过程中,裂殖子对红细胞的识别结合,具有特异性。这种特异性在于宿主红细胞膜上存在裂殖子的受体。一般认为人红细胞膜血型糖蛋白A可能为恶性疟原虫裂殖子的受体,而对血型糖蛋白B在恶性疟原虫入侵红细胞过程的作用,报道甚少,因此,本实验试图对血型糖蛋白B与恶性疟原虫入侵红细胞的关系作一探讨。 本实验分二部分。第一部分,采用改良的方法,制备了人红细胞膜血型糖蛋白B和A。首先,用蒸馏水溶破,酸沉淀的方法,制备了含血红蛋白的血影,然后用氯仿——甲醇抽提血影,得到了血型糖蛋白粗提物,再经制备性十二烷基硫酸     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体。方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting)分析其特异性。结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在1∶6 400～1∶51 200特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2。所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应。结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体。     

恶性疟原虫海南株var2csa基因DBL区蛋白的原核表达及功能分析

目的克隆、表达恶性疟原虫海南株变异抗原基因(var)家族之一var2csa基因的血型抗原结合基团(duffy anti-gen-binding ligand,DBL)4、DBL5、DBL6区,比较其与硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)黏附能力的差异。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株基因组DNA中3个目的片段,将扩增产物与pMD18-T克隆载体连接,经酶切、测序鉴定正确后克隆至表达载体pET-22b上,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,并用组氨酸标签融合蛋白纯化柱(His GraciTrap)纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)检测目的蛋白。ELISA检测不同DBL区重组蛋白与CSA的结合情况。结果 PCR扩增获得目的片段分别为996、859和894bp,酶切及DNA测序结果均显示重组质粒构建成功,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达并纯化3个DBL区重组蛋白,DBL4区、DBL5区和DBL6区的相对分子质量分别为Mr 439800,Mr ...     

恶性疟原虫FCC1／HN株EBA—175基因克隆及序列分析

目的将恶性疟原虫FCC1／HN株175ku的红细胞结合抗原（EBA－175）基因克隆人测序载体，测定其序列，为以后研究其结构与功能奠定基础。方法 利用PCR扩增技术，分两个片段从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中，特异扩增EBA－175全基因编码序列。扩增产物经纯化回收后，T－A克隆入测序载体pMD18-T,转化大肠杆菌（E.coli)DH5α，筛选阳性克隆，并进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得含有编码EBA－175基因的重组质粒pMD18-T-EBA。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定。结果 FCC1／HN株EBA－175基因序列与Camp株基本一致，全长4308bp，编码1435个氨基酸，含有与Camp株相似的C片段。利用计算机软件对其RⅡ区的F2亚区以及4肽进行抗原表位分析，结果显示这些区域可能含有抗原表位。结论 EBA－175全基因编码序列的测定，为以后其结构与功能的研究奠定基础。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株EBA-175和HRP-II基因片段在HeLa细胞中的表达及鉴定

目的在 HeLa 细胞中表达恶性疟原虫红细胞结合蛋白 EBA-175 和富组氨酸蛋白 HRP-II,进一步研究其生物学功能和免疫学特性.方法将 EBA-175和 HRP-II 部分基因串接插入 PCDNA3 真核表达载体,获得重组表达质粒 PCDNA3/EBA175-HRPII.采用磷酸钙-DNA 共沉淀法将重组质粒转染 HeLa 细胞进行体外表达,对表达产物进行 SDS-PAGE、Dot-ELISA 和 Western-blot 鉴定.结果表达产物占表达蛋白总量的16.4%,相对分子量与预设计的 48kDa 基本相符.表达产物与鼠抗恶性疟原虫血清及构建的重组质粒免疫鼠血清产生特异免疫反应.结论表达载体 PCDNA3 在 HeLa 细胞内可表达出具有一定免疫学活性的恶性疟原虫重组抗原蛋白.     

间日疟原虫Duffy结合蛋白功能区的表达、纯化及鉴定

红细胞Duffy血型阴性的个体可抵抗间日疟原虫的入侵,一个140 kDa的疟原虫蛋白——Duffy结合蛋白(PvDBP)被鉴定为能与红细胞的Duffy糖蛋白受体互补结合。在PvDBP的N-端,有一富含半胱氨酸的342个氨基酸序列(PvDBPrⅡ),也已被确认为红细     

恶性疟原虫FCC—1/HN株EBA—175和HRP─Ⅱ基因片段的体外扩增与克隆

目的构建恶性疟原虫FCC—1／HN株红细胞结合抗原（EBA—175）和富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP─Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法通过聚合酶链反应（PCR）对恶性疟原虫FCC—1／HN株的EBA─175和HRP─Ⅱ基因进行体外扩增,用HindⅢ／BamHI和BamHI／EcoRI分别消化扩增产物,定向克隆pcDNA3载体,转化至感受态大肠杆菌TG1,经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定。结果从恶性疟原虫FCC—1／HN株基因组DNA中扩增出EBA—175和HRP─Ⅱ两基因片段并定向插入PCDNA3载体构建重组质粒。结论所获重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ的基因片断。     

用无细胞蛋白合成系统重组表达恶性疟原虫蛋白的研究

目的探索无细胞麦芽体外蛋白合成系统重组表达恶性疟原虫蛋白可行性,并检测用重组蛋白制备的免疫血清对原虫蛋白的特异性反应。方法将目的蛋白PfRON2的部分片断克隆连接到重组表达载体后,用无细胞麦芽体外蛋白合成系统进行重组表达并纯化,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,并用免疫斑点实验(Western blot)和免疫荧光抗体实验(IFA)检测该血清对恶性疟蛋白的特异性反应。结果成功克隆的重组质粒能在无细胞麦芽体外蛋白合成系统中生成大小相符的GST融合蛋白,并能较好地纯化。免疫斑点实验中,用该重组蛋白制备的免疫血清能检测到重组蛋白和恶性疟目标蛋白,免疫荧光抗体实验显示该免疫血清能成功地标记恶性疟目标蛋白所在部位。结论无细胞麦芽体外蛋白合成系统可应用于恶性疟原虫蛋白的重组表达,获得的免疫血清能特异性识别疟原虫蛋白。     

伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白类似基因的原核表达和抗体制备

目的 克隆伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白（PbTIP）类似基因,原核表达PbTIP重组蛋白,并制备其抗血清。 方法 在GenBank中检索PbTIP类似基因序列,设计特异性引物,从伯氏疟原虫ANKA株扩增获得该基因cDNA片段,克隆入原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠埃希菌BL21（DE3）。经异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）鉴定重组蛋白。用重组蛋白GST-PbTIP包涵体免疫BALB/c小鼠,以间接荧光抗体试验(IFAT)和Western blotting鉴定产生的抗体。 结果 获得了纯化的重组蛋白GST-PbTIP及其相应抗体,该抗体可以识别相对分子质量（Mr）约为60 000的伯氏疟原虫感染红细胞内的PbTIP蛋白。 结论 获得PbTIP重组蛋白及其相应抗体。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫侵入与红细胞涎糖蛋白的关系

前有文献报道疟原虫裂殖子入侵宿主红细胞与红细胞上的涎糖蛋白(Sialoglycoprotein)有关,缺乏主要涎糖蛋白成分即血型糖蛋白A的红细胞对恶性疟原虫入侵具有一定的抗性。作者用不同的人红细胞和经过处理人工改变了膜上涎糖蛋白所得的红细胞对这问题作了进一步研究。结果表明:缺少血型糖蛋白A的红细胞(En(a-))和缺少血型糖蛋白B(S-s-U-和S-s-U )的红细胞对恶性疟原虫裂殖子入侵呈现明显的抗性;而用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理正常红细胞也能减少裂殖子的侵入。作者根据上述酶处理后除去了血型     

弓形虫主要表面抗原P30两个不同片段的重组表达、纯化及应用

目的将刚地弓形虫（简称弓形虫）主要表面抗原P30基因两个不同片段重组表达，纯化所获重组蛋白用于弓形虫病免疫学诊断。方法根据弓形虫P30基因的全长序列，用PCR法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段，并构建相应克隆进行诱导表达，表达蛋白以western blot鉴定。用Amylase Resin以亲和层析法纯化所表达的蛋白。以弓形虫RH株感染家兔，用粗抗原和纯化重组抗原以ELISA法比较检测各种寄生虫病患者、感染家兔血清及疟原虫感染小鼠血清。结果1．成功构建相应克隆，并成功诱导表达，表达产物经纯化后获得高纯度日的蛋白。2．重组抗原与粗抗原相比。具有相同的敏感性和更高的特异性。结论成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物。以此重组抗原与粗抗原对比检测弓形虫相应抗体，结果证明重组抗原特异性高于粗抗原。     

恶性疟原虫FCC1/HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达

目的　克隆恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)株糖酵解醛缩酶 (ALD)编码区基因。　方法　利用已知ALD基因序列设计一对特异性引物,从基因组DNA中用PCR扩增ALD基因,将其克隆入pQE30载体,阳性克隆经酶切鉴定后测序,在此基础上将重组质粒转化大肠埃希菌M15进行表达。　结果　PCR扩增后获得特异性扩增片段,测序结果显示我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与恶性疟原虫3D7株ALD基因序列完全相同。重组融合蛋白通过镍 次氮基三乙酸(NiNTA)亲和层析及阳离子交换层析进行纯化。　结论　我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与文献报道的恶性疟原虫3D7株ALD编码区基因序列相同,该融合蛋白在大肠埃希菌中获得表达     

恶性疟原虫配子体期特异性蛋白Pfgdv1克隆表达及鉴定

目的克隆恶性疟原虫配子体期特异性基因(Plasmodium falciparum gametocyte development 1 gene,Pfgdv1),体外表达和鉴定重组Pfgdv1蛋白。方法通过PCR法从恶性疟原虫感染病人血液DNA样本中扩增Pfgdv1基因,插入到原核表达载体p ET28a(+),构建p ET28a-Pfgdv1重组表达质粒,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达重组蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化产物经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定。结果 PCR扩增的Pfgdv1基因长度约为1.65 kb,重组p ET28a-Pfgdv1质粒构建成功,插入方向正确无框移,转化至E.coli BL21(DE3+)所表达的重组蛋白分子量约为67 k Da,且能被抗His标签单克隆抗体识别。结论成功克隆了Pfgdv1基因,表达并纯化了重组Pfgdv1蛋白,为进一步研究恶性疟原虫配子体期传播阻断疫苗奠定了基础。     

人红细胞膜血型糖蛋白A在恶性疟原虫入侵中的受体作用

本文在体外观察了血型糖蛋白A(GPA)及其抗体、鸡卵类粘蛋白(OM)、α_1-酸性糖蛋白(α_1-AGP)、麦胚凝集素(WGA)等对恶性疟原虫入侵红细胞的影响。在低浓度下,GPA、抗GPA-IgG和WGA对恶性疟原虫的入侵有明显的抑制作用,其浓度和抑制率间呈双曲线型量效关系,有饱和趋势。而OM、α_1-AGP及非特异性的抗血清无明显的作用。从配体-受体作用的生物学特性的角度,证实了GPA与恶性疟原虫的结合具有高度的特异性、高度的亲和力及有饱和趋势,其结合后能产生特定的生物学效应。     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的　探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法　用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果　重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论　HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 ,HRP2重组蛋白疫苗具有潜在的应用前景     

恶性疟原虫重组复合抗原的分离纯化及免疫活性鉴定

高效表达恶性疟原虫保护性抗原重组复合蛋白的工程菌ｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９，在发酵罐中发酵后收集菌体，经超声波破菌，硫酸铵分级沉淀，分子筛和离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８０％以上。纯化后的融会蛋白具有β－半乳糖苷酶的活力，用等电聚焦技术测定纯化蛋白的等电点分别为８．４和８．２５。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体以及疟区病人血清发生特异性免疫反应；重组蛋白免疫家兔后制备的抗血清可特异性地识别恶性疟原虫海南株和云南株的红内期抗原，说明我们纯化的融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复合抗原。