凋亡相关蛋白的表达及Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

背景与目的:以顺铂为基础的化疗是卵巢癌治疗的重要组成部分,对顺铂的耐药是卵巢癌治疗失败的原因之一。本研究探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株中凋亡相关蛋白表达及caspase-3活性与人卵巢癌细胞顺铂耐药的关系。方法:采用Westernblot法分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中凋亡相关蛋白bcl-2、bcl-xL、bax、bcl-xS的表达,caspase-3活性和其底物多聚ADP核糖聚合酶(PARP)的变化,并应用流式细胞仪检查不同浓度顺铂作用COC1和COC1/DDP细胞后的细胞凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,bcl-2和bcl-xL的表达明显高于COC1细胞,bax的表达无明显改变,bcl-xS在COC1和COC1/DDP细胞中均无表达。用顺铂处理后,COC1/DDP细胞中caspase-3活性、PARP裂解片段和凋亡率较COC1细胞均明显降低(P<0.05),且呈浓度依赖性。结论:人卵巢癌细胞对顺铂产生耐药可能与肿瘤细胞内凋亡抑制蛋白过度表达、caspase-3活性下降有关,而与凋亡诱导蛋白的表达无关。     

Neu RNAi对卵巢癌细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用

目的探讨nenRNAi对卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP细胞生长、凋亡及药物敏感性的作用,寻找下调基因表达并逆转化疗耐药的方法,为卵巢癌的基因治疗探索新途径。方法应用含有u6启动子的pSilencer 1．0-U6表达载体构建neu基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（pSilencer—neu）,用脂质体方法将pSilencer—neu转染卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP,另设未转染组及转染pSilencer—control组为对照。显微镜下观察转染前后细胞的变化;用RT—PCR及Western Blot检测neu基因mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化;加入顺铂后检测RNAi对SKOV3／DDP顺铂药物敏感性的影响。结果neuRNAi可明显下调卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP中neu的基因表达;使其细胞生长受到抑制,生长速度减慢,生长曲线低平;细胞凋亡增加且细胞周期发生变化,G1／G0期细胞增多,S期细胞则减少;顺铂耐药实验显示,转染RNAi的SKOV3／DDP细胞IC50明显下调,细胞凋亡率显著增加。结论应用RNAi可以部分阻抑neu基因在卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3／DDP中的表达,使SKOV3／DDP细胞生长减慢、凋亡增加,而且对顺铂的敏感性增强。     

拓扑替康诱导卵巢癌COC1/ DDP 细胞凋亡的分子机制初步探讨

  目的 探讨拓扑替康(TPT)对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP的杀伤和诱导凋亡活性及其作用机制。方法 MTT比色法与软琼脂克隆形成测定TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP的杀伤效应；TUNEL法和流式细胞仪研究TPT对靶细胞的凋亡诱导作用；Western blot检测TPT对COC1／DDP细胞内bcl-2、bax和caspase-3基因表达的影响以及caspase-3活性的改变。结果 TPT对COC1／DDP细胞有明显细胞毒性作用，不仅有剂量依赖性，也存在明显的时间依赖性；COC1／DDP细胞在TPT作用后出现特征性凋亡形态特征，且凋亡率由8．54％上升为23．16％(P<0．05)。TPT不影响COC1／DDP细胞内bcl-2蛋白表达，却明显增加19ax蛋白和caspase-3蛋白表达，并提高caspase-3活性。结论 TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP有明显的杀伤和促凋亡作用，其机制可能依赖于细胞内bax蛋白表达增高和caspase-3的活化。     

拓扑替康促人卵巢癌顺铂耐药细胞株凋亡机制的初步研究

目的探讨拓扑替康(TPT)对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP和COC1/DDP的杀伤和诱导凋亡活性及其作用机制.方法用MTT比色法测定TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP和COC1/DDP的杀伤效应;透射电镜和DNA凝胶电泳研究TPT对靶细胞的凋亡诱导活性;Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达.结果TPT对A2780/DDP和COC1/DDP细胞均有较强的体外杀伤作用,其IC50值分别为102.91 ng/ml和111.75 ng/ml;TPT能诱导A2780/DDP和COC1/DDP细胞产生凋亡,DNA凝胶电泳呈现典型的凋亡梯度,透射电镜观察到细胞核染色质固缩、边集,胞质浓缩,出现空泡等典型的凋亡超微结构改变;TPT不影响bcl-2蛋白表达,却能上调bax蛋白表达,增大bax/bcl-2比值,且呈剂量依赖性.结论TPT对人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP和COC1/DDP均有明显的杀伤和促凋亡作用,其机制可能与bax基因表达上调而提高bax/bcl-2比值有关.     

siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转

目的：探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因逆转A549/DDP细胞耐药的可行性。方法：采用RT-PCR方法检测MT1H基因在A549和其顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达;将针对MT1H的siRNA导入A549/DDP细胞;用RT-PCR和斑点印迹方法分析MT1H基因表达情况;MTT法观察细胞顺铂耐药性;TUNEL、流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡率;免疫细胞化学分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：MT1H在A549/DDP细胞中高表达但不在A549细胞中表达;A549/DDP细胞转染48 h后,与对照组比较,MT1HsiRNA转染组MT1H mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞对DDP的药物敏感性明显提高,DDP诱导凋亡率明显增加,Bcl-2表达明显下降,Bax表达无变化。结论：MT1H基因沉默能降低Bcl-2表达,增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡诱导作用,有效逆转A549/DDP细胞耐药。     

下调Beclin1 抑制卵巢癌A2780/DDP细胞对顺铂的耐药性

目的：探究敲减Beclin1 表达对卵巢癌细胞A2780 对顺铂耐药的影响及其相关机制。方法：以Western blotting 及qPCR 检测卵巢癌细胞株A2780 及耐药细胞株A2780/DDP 中Beclin1 的表达情况；A2780/DDP 细胞转染Beclin1 siRNA 后，用MTT法检测细胞对顺铂敏感性的变化，克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成情况，流式细胞术检测各组细胞的凋亡，MDC荧光染色检测细胞的自噬情况，Western blotting 检测自噬相关蛋白、溶酶体相关膜蛋白Lamp-2 以及组织蛋白酶Cathepsin B的表达情况。结果：顺铂耐药细胞株A2780/DDP 中Beclin1 mRNA及蛋白的表达水平均明显高于A2780 细胞株（均P<0.05），在A2780细胞中加入顺铂刺激后Beclin1 蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）。敲减Beclin1 表达可促进顺铂诱导的A2780/DDP 细胞的凋亡（P<0.05）、抑制细胞自噬的发生（P<0.05）、减少细胞克隆形成（P<0.05）和增加细胞对顺铂的敏感性（P<0.05）；Western blotting结果显示，敲减Beclin1 可上调A2780/DDP 细胞中cleaved-caspase 3 和Cathepsin B的蛋白水平，下调Atg3、Atg7、LC3Ⅱ/Ⅰ、Lamp-2的表达水平（均P<0.05）。结论：敲减Beclin1 表达可提高A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性，其机制可能与调节自噬相关蛋白表达抑制细胞保护性自噬和影响溶酶体功能，从而促进顺铂诱导耐药细胞凋亡有关。     

增强c-Jun氨基末端激酶活性可逆转卵巢癌的顺铂耐药性

目的: 探讨卵巢癌的顺铂(cisplatin,CDDP)耐药以及如何促使其逆转的机制.方法:将携带c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun NH2-terminal kinase 1,JNK1)显性突变体的质粒pcDNA3(FLAG)-JNK1-dn及表达野生型JNK1的质粒pcDNA3(FLAG)-JNK1-wt分别转染卵巢癌A278细胞和A2780/DDP耐药细胞株.20 μmol/L CDDP作用后,检测细胞中p-JNK及下游p-c-Jun的表达,观察2株细胞的凋亡率及CDDP作用后2株细胞中Fas/FasL的表达.结果:CDDP作用后A2780细胞中p-JNK及下游p-c-Jun持续表达,而A2780/DDP细胞中仅有短暂表达.pcDNA3(FLAG)-JNK1-dn转染A2780细胞可抑制CDDP诱导的JNK1活性,并使细胞的凋亡率明显低于未转染组[(18.3±0.4)% vs (47.3±4.7)%, P <0.01].pcDNA3(FLAG)-JNK1-wt转染可使JNK1持续活化,FasL表达上调,A2780/DDP细胞凋亡率明显高于未转染组[(36.9±1.6)% vs (10.9±1.7)%, P <0.01]. 结论:JNK信号转导通路在CDDP诱导的卵巢癌细胞凋亡中起重要作用.野生型JNK1基因转染使A2780/DDP细胞对CDDP的耐药性得到逆转.     

转染BAX基因对A549细胞系的凋亡及化疗敏感度的影响

目的 探讨BAX转染是否增强人肺癌A549细胞对顺铂致凋亡的敏感度。方法 通过CCK8法检测顺铂对A549细胞体外增殖的影响。应用脂质体介导重组真核表达载体BAX-pcDNA3.1和空载体pcDNA3.1质粒转染至人肺癌A549细胞中,G418筛选阳性细胞。RT-PCR法检测BAX在A549细胞中的表达。将不同浓度的顺铂分别作用于A549、A549/BAX和A549/pcDNA3.1细胞72 h,CCK8法测定各组细胞的存活率,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果 顺铂能抑制A549细胞体外生长,BAX和顺铂使A549细胞发生G₁/S期细胞阻滞。RT-PCR显示转染BAX基因的A549细胞中BAX表达显著增加,转染BAX基因及加药组细胞凋亡率明显增加。 结论 稳定转染BAX基因明显增强A549细胞对顺铂致凋亡作用的敏感度。     

细胞色素c 介导的半胱天冬氨酸蛋白酶-3活性改变与人卵巢癌顺铂耐药的关系

目的：探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780／DDP、COC1／DDP中抗凋亡基因bcl-XL、细胞色素c的表达和半胱天冬氨酰蛋白酶－3（caspase-3)活性对人卵巢癌顺铂耐药的影响。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）和Western blot检测人卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780、COC1和顺铂耐药株A2780／DDP、COC1／DDP中bcl-XL的表达,以及顺铂作用后细胞色素c的含量和caspase-3活性的变化,并应用流式细胞仪测定顺铂作用后A2780、COC1、A2780／DDP、COC1／DDP细胞的凋亡率。结果：bcl-XL在A2780/DDP、COC1／DDP细胞中的表达明显高于A2780、COC1细胞;顺铂作用后,细胞色素c在A2780／DDP、COC1／DDP细胞中的表达明显减少,caspase-3活性和凋亡率也较A2780和COC1细胞明显降低（P＜0．05）。结论：人卵巢部细胞对顺铂产生耐药可能与细胞内bcl-XL过度表达、细胞色素c释放受抑制和caspase-3活性下降有关。     

溶血磷脂酸抑制顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡

目的：探讨溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的抑制作用及其作用机制。方法：体外培养卵巢癌细胞株SKOV3,采用MTT法检测LPA对顺铂（cisplatin,DDP）作用后卵巢癌细胞株SKOV3增殖活性的影响,Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞,用FCM法分析细胞周期变化和细胞凋亡率,DNA片段凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA“梯状”条带,免疫细胞化学法及RT-PCR法分别检测细胞凋亡相关蛋白及其mRNA的表达。结果：LPA能降低DDP对SKOV3细胞生长的抑制作用,同时增加G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例和凋亡率。Hoechst33258染色检测示LPA作用后凋亡小体明显减少。DNA片段凝胶电泳示LPA作用后不产生明显的凋亡片段。10μmol/L的LPA作用SKOV3细胞48h后,bcl-2基因及其蛋白表达水平升高,而bax基因及其蛋白表达水平降低（P〈0.01）。结论：LPA可通过上调bcl-2基因及蛋白表达,下调bax基因及蛋白表达,抑制DDP诱导的卵巢癌细胞凋亡。因此,针对LPA的治疗有望提高DDP疗效,改善卵巢癌患者的预后。