表达大肠杆菌肠毒素ST_1—LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＬＤ１００的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

CPB-ST融合基因的构建及表达研究

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ双酶切含有大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１前体蛋白基因的质粒ｐＸＳＴ１，回收３２５ｂｐ的ＳＴ基因片段，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的带有产气荚膜梭菌β－毒素基因（ＣＰＢ）的重组质粒ｐＥＣＢ２中ＣＰＢ基因的下降，转化受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切反应鉴定重组质粒，得到了理想重组质粒ｐＥＣＢ－ＳＴ１。重组菌株Ｂｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＣＢ－ＳＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ及ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以表达ＣＰＢ－ＳＴ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然β－毒素和ＳＴ１的生物毒性。     

Cry1Ie基因在大肠杆菌中的表达及等同性鉴定

目的以Cry1Ie基因表达蛋白为模式蛋白,建立外源基因表达蛋白的技术平台。方法利用大肠杆菌系统高效表达Cry1Ie蛋白,并采用SDS-PAGE技术分离纯化,通过生物学活性和免疫反应性2项指标检测了大肠杆菌表达蛋白与转基因玉米中蛋白的等同性。结果大肠杆菌表达系统可以产生大量的Cry1Ie蛋白,所获得的蛋白与转Cry1Ie玉米表达的Cry1Ie蛋白有相同的免疫反应性和生物活性。结论大肠杆菌表达系统可以作为Cry1Ie外源基因蛋白表达技术平台用于转基因植物食用安全性的初步研究。     

Dectin-1融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠Dectin-1融合蛋白真核表达质粒并进行真核表达初步研究.方法 运用RT-PCR技术扩增小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因的细胞外碳水化合物识别域(CRD),与真核表达载体pSecTag2C进行双酶切之后进行连接反应,构建重组融合表达载体,转染入293细胞中,目的 蛋白在细胞培养基中分泌表达,表达产物经蛋白浓缩、纯化后经SDS-PAGE、Western印迹鉴定.结果 获得重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,测序结果 证明质粒DNA序列完全正确,并在转染入293细胞后检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建重组真核表达载体pSecTag2C-Dectin-1,为进一步纯化蛋白研究真菌检测方法 及Dectin-1与真菌相互作用机制、功能等奠定了基础.     

WT-1和EGR-I基因在肾胚瘤中的表达

肾胚瘤是一种较常见的儿科实体肿瘤 ,该肿瘤的遗传学基础比较复杂 ,现已发现有多个染色体位点与其发生有关 ,其一是定位于染色体 11p13的抑癌基因WT -1,据统计约 5%～ 2 5%的肾胚瘤发生WT -1基因的改变 ,WT -1蛋白在细胞增殖、分化及凋亡等方面均有一定作用〔1,2〕。通过比较WT-1锌指区的氨基酸序列和其它锌指蛋白的氨基酸序列发现 ,WT -1和EGR -I有着高度相似性 ,现认为WT -1可识别并结合于EGR -IDNA一致序列 (GCGGGGGCG) ,WT -1蛋白能抑制促进细胞生长的EGR -I基因的表达 ;细胞内WT -1和EGR -I蛋白的浓度维持平衡对于细…     

GFP—ICP0融合蛋白高表达增强活化巨噬细胞分泌TNF—α和IL-1β

目的研究GFP—ICP0融合蛋白瞬时高表达对活化巨噬细胞分泌活性的影响。方法构建GFP—ICP0融合蛋白真核细胞表达载体pEGFP／ICP0。将其转染巨噬细胞，用荧光显微镜观察GFP—ICP0融合蛋白在巨噬细胞内的表达与定位，并利用Western blot检测表达产物。通过GFP—ICP0融合蛋白在巨噬细胞内的瞬时高表达，在LPS诱导激活巨噬细胞后12、24、48h时，测定活化巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的含量。结果GFP—ICP0融合蛋白在巨噬细胞内瞬时高表达且定位于细胞核。GFPICP0融合蛋白在巨噬细胞内的高表达，使LPS诱导活化的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β量明显增加（在12、24与48h时与对照组差异有显著性，P〈0．01）。结论ICP0即时高表达可上调．活化巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。     

肠毒素大肠杆菌LTh—STIb二价基因探针的克隆及其应用研究

在肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）ＬＴｈ－ＳＴＩａ－ＳＴＩｂ三阶价基因探针的基础上，用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ酶切，回收片段，重新构建ＩＴｈ－ＳＴＩｂ二价基因探针的克隆株。用辣根过氧化物酶复合物直接标记二价基因探针，建立了增强型学化反应检测的方法，其敏感性可测到０．１ｐｇ的质粒ＤＮＡ或由１０个菌体培养而来的ＥＴＥＣ细胞，与同位素标记杂交方法的敏感性一致。     

新型呼肠病毒S1基因的表达鉴定

目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白的编码基因S1的重组原核表达质粒,对其在原核细胞内的表达进行研究。方法将S1基因克隆入原核表达载体pProEX HTa,构建重组原核表达载体pPLS,通过IPTG诱导,利用蛋白电泳和蛋白免疫印迹等方法对其在大肠杆菌中的表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western-blot的检测结果一致表明,诱导后1~5 h均可检测到目的蛋白的表达,其中以5 h的蛋白表达量最大,且表达的目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在。结论通过构建重组原核表达质粒,可使目的蛋白σ1得到诱导表达,为后续抗体制备及研究病毒-宿主相互作用提供实验基础。     

乙型脑炎病毒NS1基因片段的克隆、表达及鉴定

目的构建乙型脑炎病毒NS1基因的重组原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及免疫学鉴定。方法以乙型脑炎病毒基因组为模板,RT-PCR扩增NS1基因片段,构建其重组原核表达载体,并采用WesternBlot方法初步鉴定该蛋白的特异性。结果成功扩增出乙型脑炎病毒NS1基因片段,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特异性识别乙型脑炎患者血清。结论在大肠杆菌中成功表达乙型脑炎病毒NS1基因片段,为乙型脑炎病毒的诊断提供了新的特异性抗原。     

人肺癌相关基因HLCDG1在大肠杆菌中的表达

目的构建新克隆的肺癌抑瘤基因候选者HLCDG1的融合表达质粒pGEX-6P-1/HLCDG1并在原核表达系统中表达。方法采用多聚酶链式反应(PCR)扩增HLCDG1基因蛋白编码序列,将该片断插入原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL-21扩增。构建的融合表达质粒经酶切和测序鉴定后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色和W estern b lot鉴定实验结果。结果构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中经IPTG诱导出一条分子量约为46kD的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,W estern b lot鉴定其为GST-HLCDG1融合蛋白。结论HLCDG1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中有效表达,为进一步研究该蛋白质的结构和功能奠定研究基础。     

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。     

细菌素PediocinPA-1融合蛋白的表达纯化

目的在原核中表达和纯化融合蛋白。方法 IPTG诱导融合蛋白表达,表达的融合蛋白经金属镍离子螯合亲和层析纯化后,用分子筛Superdex G75进一步纯化和鉴定。结果诱导表达后,通过SDS-PAGE分析,融合蛋白主要存在上清中,金属螯合层析和分子筛纯化后,所得融合蛋白的纯度大于90%。结论获得纯化的融合蛋白,为进一步研究和应用奠定基础。     

风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1在原核细胞的表达及免疫效果观察

目的:人乳头瘤病毒16型(HPV16)疫苗的研制可望防治宫颈癌的发生、发展,本实验从中国感染人群中克隆L1基因,期望制备中国人群的HPV16的预防性疫苗。方法:从HPV16阳性的尖锐湿疣临床标本中,PCR扩增HPV16 L1基因,克隆、测序,并在原核细胞表达L1蛋白,纯化蛋白经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(VLP),VLP免疫动物观察抗体产生情况。结果:克隆的HPV16 L1,测序结果发现有4个特异性突变位点是nt6240的C-G、nt6432A→G、nt6901~03及nt6951~53。将HPV16L1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),高表达的蛋白应用蛋白转印证实是HPV16L1蛋白,纯化的蛋白复性后可以自组装VLP,免疫动物产生高滴度的抗体。结论:从临床标本克隆表达了HPV16 L1基因,可以在原核细胞高表达及体外组装VLP,并且具有良好的免疫原性。为研制HPV16预防性疫苗探索一条易于推广而经济的制备途径。     

大鼠生精相关基因TSARG1原核表达载体的构建和表达

目的构建大鼠生精相关基因pGEX-KG/TSARG1重组载体并进行原核表达。方法应用RT-PCR技术从大鼠睾丸组织mRNA中扩增TSARG1的开放阅读框（ORF）,T-A克隆后将TSARG1插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/TSARG1融合蛋白。结果成功构建pGEX-KG/TSARG1重组质粒;转化重组质粒的E.coli BL21经IPTG 37℃诱导高效表达GST/TSARG1融合蛋白。结论 pGEX-KG/TSARG1原核表达载体的成功构建为进一步研究TSARG1的生物学功能奠定了基础。     

麻疹病毒血凝素基因在大肠杆菌中的原核表达

目的构建麻疹病毒(measles virus)血凝素蛋白(H蛋白)基因的重组质粒,使其在大肠杆菌中大量表达H蛋白,为制备重组蛋白用于免疫检测奠定基础。方法提取麻疹病毒Leningrad-4株总RNA,RT-PCR法扩增其血凝素基因。克隆入pGEM-Teasy载体,双向测序,测序正确后将Ha基因用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后亚克隆至pET28a(+)载体,转化BL21(DE3)。培养后用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分离大肠杆菌蛋白,分析H基因表达情况。HisLink树脂纯化目的蛋白用于建立酶联免疫吸附反应,进行血清抗体水平检测。结果扩增了麻疹血凝素基因,与麻疹Leningrad-4株血凝素基因同源性达99.8%,构建了重组血凝素基因的原核表达质粒并进行了诱导表达和SDS-PAGE凝胶电泳,在66 kD处有表达的重组血凝素蛋白条带。结论成功构建了麻疹血凝素基因的表达载体并在大肠杆菌中进行了诱导表达,建立了利用重组血凝素蛋白检测IgG的ELISA方法。     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

风疹病毒E1蛋白与DsbA蛋白原核融合表达及应用

目的 利用DsbA蛋白分子伴侣性质,原核系统内可溶性表达风疹病毒E1蛋白并进行纯化,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM. 方法 将PCR扩增的风疹病毒E1核酸序列克隆至融合表达载体pET-DsbA中,依次进行表达和亲和纯化,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定DsbA-E1融合蛋白的抗原性及实用性. 结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗风疹病毒IgM阳性血清和60份健康人血清,其中阳性血清检出例数为45例,检出率为75％;健康人血清检出1例,检出率为1.7％,特异度为98％;用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.3％ (59/60),阴性检出率100％,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性. 结论 融合蛋白DsbA-E1在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,该重组蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

尿道致病性大肠杆菌fimA基因的克隆与表达

目的 对尿道致病性大肠杆菌(UPEC)132编码Ⅰ型菌毛的结构基因fimA进行克隆与表达,建立免疫学检测方法.方法 采用PCR方法扩增fimA基因,定向克隆pET32a载体,原核表达获得FimA重组蛋白;免疫小鼠制备FimA多克隆抗体;建立全菌ELISA方法,检测UPEC 132的Ⅰ型菌毛表型.结果 PCR扩增imA全基因,构建重组质粒pET32a-fimA,经转化构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-fimA;经IPTG诱导表达及镍亲和层析纯化获得重组蛋白FimA;制备的FimA多克隆抗体效价≥1:51 200,Western blot显示其良好的特异性;全菌ELISA获得满意结果.结论 成功地克隆UPEC Ⅰ型菌毛的结构基因fimA,制备的多克隆抗体为UPEC的检测和致病性的研究奠定了基础.