重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。     

重组人白细胞介素—2／粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的：研究重组人白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法：常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得副合蛋。结果：获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论：此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。     

利用CEA694-702-β2m融合蛋白制备HLA-CEA694-702复合体

目的：获得大量CEA694-702-β2-微球蛋白（β2m）融合蛋白,并制备HLA-CEA694-702复合体。方法：通过引物设计在β2m基因的5′端引入CEA694-702序列和L inker序列,并将目的基因克隆到质粒pET28 a中,在BL21（DE3）中表达。CEA694-702-β2m和HLA重链蛋白用金属螯合亲和层析法进行纯化,并经稀释复性法复性。制备的HLA-CEA694-702复合体用PEG20000浓缩,应用ELISA鉴定其构象,并用尺寸排阻色谱纯化和鉴定。结果：HLA重链蛋白和CEA694-702-β2m蛋白经金属螯合亲和层析法纯化后纯度提高。ELISA鉴定结果表明稀释复性后HLA-CEA694-702复合体形成了正确的构象。利用尺寸排阻色谱对HLA-CEA694-702复合体成功地进行了纯化。结论：利用CEA694-702-β2m融合蛋白成功制备出HLA-CEA694-702复合体,为HLA-CEA694-702四聚体的制备奠定了基础。     

重组人白细胞介素-17的复性研究

目的探讨重组人白细胞介素-17(rhIL-17)的复性条件。方法表达重组人白细胞介素-17的大肠杆菌经破碎、包涵体洗涤、裂解提取、复性、Sephacryl S-100层析柱纯化等技术方法,对复性相关参数进行优化。结果经纯化得到rhIL-17,蛋白纯度为97.2%,探索到了rhIL-17蛋白复性的最适条件。结论通过复性与纯化获得了高纯度有活性的rhIL-17。     

小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达、纯化与鉴定

目的构建小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)工程菌,通过摸索其变、复性和纯化条件,得到高纯度高比活的重组mGM-CSF蛋白。方法以本实验室构建的hIL-2/mGM-CSF融合蛋白表达载体为模板,PCR扩增mGM-CSF基因,克隆入pET-11c表达载体,转化BL21,构建BL21/pET-11c/mGM-CSF工程菌,用本所专利方法提取包涵体,在含低浓度盐酸胍的复性液中复性,采用镍离子亲和层析纯化。结果工程菌采用TH肉汤培养,32℃、0.1mmol/LIPTG双重诱导,表达量达菌体蛋白总量的60.6%。提取包涵体在含1.5mol/L盐酸胍的谷胱甘肽复性液中复性效果最好,比活达4.2×106U/mg。经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达95%,比活与标准品相当。结论构建了高效表达mGM-CSF的工程菌,建立了其复性和纯化工艺,为进一步研究DC、GM-CSF体内抗肿瘤功能奠定了基础,并可为IL-2/GM-CSF双功能分子的生物学功能研究提供对照。     

硫氧还蛋白-(His)6融合的瑞替普酶的表达、纯化和活性检测

目的:构建硫氧还蛋白-(His)6-瑞替普酶融合表达载体,提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量,简化rPA的分离纯化.方法:将rPA基因克隆于原核表达载体pET32a硫氧还蛋白-(组氨酸)6标签下游,在大肠杆菌BL21(DE3)中用乳糖进行诱导表达.采用一步稀释法对融合蛋白体外复性后,使用Ni2 亲和层析柱,对包涵体复性液进行初步纯化.采用体外溶圈法对复性后和纯化后的融合蛋白进行生物活性的测定.结果:得到分子量约为56 kDa的融合蛋白,表达量达到总蛋白的30%以上.比本实验室构建的非融合表达载体表达量提高了约50%.经过一步Ni2 亲和层析,融合蛋白纯度达到80%以上.体外溶圈法实验表明融合蛋白复性后和纯化后具有溶栓活性.结论:与非融合表达相比,融合表达的表达量明显提高.即使N端额外融合一段融合多肽,rPA仍然具有生物学活性.     

融合表达的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素包涵体复性的研究

目的 构建融合表达载体,获得具有生物活性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。方法 克隆tlh基因,构建表达载体pET32a+/tlh,融合表达副溶血弧菌不耐热性溶血毒素,用8 mol/L的尿素溶解包涵体,亲和层析纯化目的蛋白,采取逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂等复性方法。结果 复性蛋白具有溶血活性及免疫原性。结论 通过克隆tlh基因,构建融合表达载体pET32a+-tlh,采取纯化、复性方法,获得具有融血活性及免疫原性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。     

重组人白细胞介素2—绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的 探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2－绿脓杆菌外毒素（IL－2－PE66^4lu）融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法 采用该所发明的新方法提纯包涵体，包涵体复性后，样品经DEAE＝SepharoseFF离子交换层析，获得融合蛋白纯品。结果 获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95％，复性咽收率为80％。结论 此包涵体分离纯化技术简便、实用，可为中试研究和规模化生产提供基础。     

大肠埃希菌表达的含PTD穿膜序列的融合蛋白3种复性方法比较

目的:探索融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP纯化以及复性的条件,以提高其复性效率,为后续融合蛋白生物学功能的研究做准备。方法:表达、提取并纯化包涵体形式的融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP,分别用稀释复性、透析复性、柱上复性的方法,对融合蛋白进行复性,分析不同方法的特点及包涵体复性率,采用流式细胞术检测融合蛋白的穿膜活性。结果:3种复性方法得到的融合蛋白复性率依次为:柱上复性得率最高,其次是透析复性,稀释复性得率最低。柱上复性后蛋白的穿膜效率最高,相对较低的是稀释复性,而未复性的融合蛋白穿膜效率极低。结论:3种复性方法均能对PTD穿膜蛋白复性,但以柱上复性最佳。     

乙型肝炎病毒前S2/S与重组人GM-CSF融合基因的分子克隆及鉴定

目的为探讨乙型肝炎病毒前S2(preS2)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)对乙型肝炎疫苗的免疫增强作用,构建S2／S(preS2 HBsAg)与GM—CSF融合基因真核表达载体。方法采用PCR技术分别扩增出S2／S大小约846bp的编码基因片段和带有15个甘氨酸接头序列的GM—CSF约450bp编码基因片段,经T-A克隆后分布克隆至载体PcDNA3．1中,获得PcDNA3．1-S2／S-GM-CSF融合基因表达载体,利用酶切、PCR和DNA序列测定进行鉴定插入片段的大小和方向。结果经过鉴定该融合基因全长约1300bp,证实为S2／S-GM-CSF融合基因。结论乙型肝炎病毒(HBV)S2／S和GM—CSF融合基因真核表达载体构建成功,为进一步研究其表达和生物学活性奠定了一定基础。     

重组人白细胞介素17的纯化及生物活性鉴定

目的：探讨重组人白细胞介素17的复性与纯化方法,并进行活性鉴定.方法：表达重组人白细胞介素17（rhIL-17）的大肠杆菌经破碎、包涵体洗涤、裂解提取、复性、Sephacryl S-100层析柱纯化等方法,获得rhIL-17;通过ELISA方法检测IL-6的含量,间接反映rhIL-17的生物学活性.结果：经纯化得到rhIL-17,其相对分子质量为159 000,蛋白纯度为97.2%,能够刺激人胚肺成纤维细胞MRC-5产生IL-6,呈浓度依赖关系.结论：通过本方法复性与纯化获得高纯度、有生物学活性的rhIL-17.     

脲梯度体积排阻色谱复性并同时纯化rhSCF

目的:用脲梯度体积排阻色谱(SEC)复性并同时纯化在大肠杆菌中高表达的人干细胞因子.方法:采用脲梯度SEC,根据蛋白质与小分子物质分离过程的迁移速度不同的原理,在色谱过程中通过脲浓度的线性梯度洗脱方式脱除变性剂脲而达到蛋白复性并同时纯化.结果:用脲梯度SEC复性重组人干细胞因子(rhSCF)能够使复性蛋白的产率提高,色谱过程中洗脱长度、流速以及蛋白浓度的变化对蛋白复性效率都有不同的影响.结论:用脲梯度SEC复性rhSCF可以使复性产率提高,其质量回收率从35.2%提高到51.4%.     

大肠杆菌表达重组人IL-8分离纯化工艺的建立

目的　建立重组人IL - 8(rhIL - 8)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺 ,以便获得高纯度的重组蛋白。方法　将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB10 1,经IPTG诱导进行高效表达。将离心收集到的菌体用超声破壁分离 ,收集包涵体和胞浆 ,其中包涵体部分经变性和复性处理后 ,与胞浆部分合并 ,进行肝素亲和层析柱分离 ,再经离子交换柱和凝胶层析柱过滤 ,得到最终纯品。蛋白纯度用SDS -PAGE鉴定 ,ELISA法检测重组IL - 8含量。检测纯化后重组蛋白的生物学活性和热源质。结果　用大肠杆菌HB10 1表达重组人IL - 8,具有较高的表达量 (2 5mg/ml) ,其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在。经多步柱层析纯化后 ,可获得高纯度的重组IL- 8蛋白 (纯度 >95 % )。该蛋白在体外具有趋化中性粒细胞游走的作用 ,兔温法检测热源质含量符合要求。结论　大肠杆菌可高效表达rhIL - 8,该工艺流程可从大肠杆菌载体中获得具有生物学活性的高纯度rhIL - 8。     

重组hIL-17B/His原核蛋白表达和生物学活性初步研究

目的研究原核表达hIL-17B/His重组蛋白及生物学活性。方法 RT-PCR法克隆去信号肽的hIL-17B基因序列。将测序后的hIL-17B分子扩增产物插入PQE3.0载体构建hIL-17B/PQE3.0重组载体。再将该重组载体导入M15工程菌,应用异丙基B-D硫代半乳糖苷诱导后表达hIL-17B/His重组蛋白,并经Western blot实验证实。结果获得原核表达的hIL-17B/His重组蛋白。体外实验表明,该融合蛋白具有上调人巨噬细胞TNF-α、IL-1β等分子表达的作用。结论原核表达获得具有生物学活性的hIL-17B重组蛋白,为进一步研究该分子的生物学功能提供了物质条件。     

基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化

目的 对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法 以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果 经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论 成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.     

Purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4GLU)) fusion protein.]

OBJECTIVE: To evaluate the effect of a novel approach for purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4Glu)) fusion protein. METHODS: A novel purification method established in our laboratory was adopted for the purification of the inclusion body, and after renaturation, recombinant human IL2-PE66(4Glu) fusion protein was purified by DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatography. RESULTS: The purity of the fusion protein that retain its biological activity was as high as 95%, and a recovery rate over 80% of the refolded IL2-PE66(4Glu) fusion protein was achieved. CONCLUSION: The purification and refolding method for inclusion body adopted in this study is simple and practical, which lays the foundation for a large-scale production of the fusion protein.     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

目的：以人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAc-12）为研究对象，利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌（E．Coli）BL21中原核表达其编码序列，并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法：首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3，形成重组表达质粒pGEX-5X-3／T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α，测序鉴定后转化BL21，异丙基硫代半乳糖（IPTG）诱导后，表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖（Glutathione-Sepharose）4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能，设计底物，建立酶促反应体系，利用高效液相色谱（HPLC）进行酶活分析。结果：成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3／T2，通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达，利用亲和层析得到纯化的酶蛋白，并经Western印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论：成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3／T2，ppGalNAc-T2伞长编码序列被成功表达、纯化及复性，检测到具有酶活性。     

重组人血管生长素的纯化

目的 建立表达重组人血管生长素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，ｒｈＡＮＧ）的简便纯化工艺，为扩大生产及临床应用打下基础。方法 工程菌经超声破碎，离心洗涤后，变性萃取ｒｈＡＮＧ的包涵体，通过ＳｅｐｈａｃｒｙＳ－２００柱层析分离，再经ＣｕＣｌ２复性，得到ｒｈＡＮＧ纯品。结果 所获取ｒｈＡＮＧ的纯度达９６％以上，蛋白回收率为８０％，活性测定经鸡胚绒毛尿囊膜（ｃｈｏｒｉｏａｌｌ     

Study of renaturation condition of anti-TNF-α recombinant antibodies

Recolnbinant Protein of antibody empressed in foreignhosts (generaly Eschewhia colt) may accumulate in insoluble fonnS--inclusion bodies, which has not any biological activity. In most cases, insoluble inclusion bodiestend to Predondnate at higher expression levels. Recentstudies have revealed that the refolding of protein as wellas dissolving inclusion bodies into functional Protein mayl)e associated with denatu~ and renatllrant. In this paperl we used two eXPression productS as objects, w…