表达hEGF导入基因的角朊细胞促进体外培养的正常角朊细胞增殖

目的 观察含外源性人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因改造的角朊细胞（ｈＥＧＦ－ＭＨＫ），对正常培养的角朊细胞（ＮＨＫ）增殖的影响；探讨转ｈＦＧＦ对创面愈合的生物学效应及作用机理。方法 收集含真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈＥＧＦ的Ｈｅｇｆ－ＭＨＫ细胞培养上清，采用放射免疫分析法检测收集的上清液中ｈＥＧＦ含量；以１０％的浓度加入由正常人皮肤组织分离培养的ＮＨＫ细胞培养基内；ＭＴＴ法测定ＮＨＫ细胞增减１５     

人表皮生长因子基因的克隆及其真核表达载体的构建

人表皮生长因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｈＥＧＦ）具有促进表皮细胞增殖的作用，与免疫性皮肤病及创面组织修复有着密切的关系。随着分子生物学理论和技术的发展，人们对外源性基因在真核系统中表达的机理有了进一步了解〔１〕。为了进行ｈＥＧＦ基因的真核表达及表皮组织基因治疗方面的研究，我们采用逆转录ＰＣＲ方法扩增了ｈＥＧＦ及其信号肽基因，并选用ｐＢＫＣＭＶ穿梭质粒构建了ｈＥＧＦ基因真核表达质粒。１　材料和方法１．１　主要试剂限制性内切酶ＮｈｅⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ及Ｔ４Ｄ…     

hG－CSF cDNA重组逆转录病毒的构建

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ重组入逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ中。重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清液能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆。该克隆细胞染色体中成功地整合了ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ，并且表达了有生物学活性的ｈＧ－ＣＳＦ产物。     

hG—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ重组入逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ中。重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清液能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆。该克隆细胞染色体中成功地整合了ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ，并且表达了有生物学活性的ｈＧ－ＣＳＦ产物。     

rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

小鼠神经生长因子cDNA的克隆及核苷酸序列分析

用Ｔ４－ＤＮＡ连接酶在限制性内切酶ＳｍａＩ存在下，将神经生长因子ｃＤＮＡ片断克隆到具有双向转录启动子的载体质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中。Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定其核苷酸顺序表明，所克隆的ＮＧＦｃＤＮＡ片断，长３６３ｂｐ，包含了成熟神经生长因子的全部编码。该重组质粒可分别用于制备ＮＧＦｃＤＮＡ探针和ＲＮＡ探针，是研究ＮＧＦ基因结构及表达调控等方面的重要工具。     

可溶性E—选择素cDNA基因克隆及其真核表达

从ｐＵＣ１８／Ｅ－选择素重组质粒经ＰＣＲ扩增得到可溶性Ｅ－选择素ｃＤＮＡ基因，将此基础插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｓｍａ Ｉ位点，构建了正向表达质粒ｐＪＳＡ１１７５．可溶性Ｅ－选择素，采用脂质供共转染的方法，将上述质粒转染ＴＫ＾－１４３细胞。     

人脑源性神经营养因子及神经营养素—3重组腺病毒的构建及鉴定

目的：构建人脑源性神经营养因子和神经营养素－３重组腺病毒，使其携带神经营养因子感染神经系统细胞，在局部释放有生物活性的营养因子。方法：Ｕ针人全长ＢＤＮＦ与ＮＴ３基因分别插入ｐＣＤＮＡ３载体，然后将表达序列ＣＭＶ－ＢＤＮＦ－ＢＧＨｐＡ和ＣＭＶ－ＮＴ３－ＢＧＨｐＡ切下，插入Ｅ１区缺失的腺病毒载体ｐＨΔＥｌｓｐ１Ａ中，与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞，通过同源重组产生重组腺病毒。结果和结论：经过二次ＣｓＣｌ     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究     

运用双杂交系统探寻与内皮素A型受体相互作用的蛋白质

目的：运用酵母双杂交系统寻找与内皮素Ａ型受体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｔｙｐｅＡｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＴａＲ）相互作用的蛋白质，为探讨心血管等疾病的致病机理及采取相应的治疗策略提供理论依据，方法：首先将ＥＴＶＲ胞内区ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＧＢＴ９质粒载体中，得到的重组质粒ｐＧＢＴ９－ＥＴｖＲ转化酵母菌ＨＦ７Ｃ，然后将鼠胚胎文加质粒转化到ＨＦ７Ｃ（ｐＧＢＴ９－ＥＴｖＲ）中，用Ｔｒｐ＾－Ｌｅｕ＾－Ｈｉｓ＾－营     

PDGF-B基因表达及其对成纤维细胞增生和胶原合成的促进作用

目的建立稳定表达人血小板衍生生长因子－ＢＢ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ＢＢ，ＰＤＧＦ－ＢＢ）的细胞株，并考察该重组蛋白与损伤修复有关的生物学作用。方法将含ＰＤＧＦ－Ｂ基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３转染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３中，在Ｇ４１８选择压力下得到抗性克隆，收集扩增的抗性克隆培养液并制备细胞膜上ＰＤＧＦ－ＢＢ蛋白质，３Ｈ－ＴｄＲ掺入法表达产物的生物学活性，并以３Ｈ－Ｐｒｏ掺入测胶原合成率。结果免疫荧光染色法证实抗性细胞中ＰＤＧＦ－ＢＢ的表达，膜上ＰＤＧＦ－ＢＢ显著促进ＮＩＨ３Ｔ３细胞ＤＮＡ合成，活性可达约３１．２Ｕ／１０６细胞，而培养液的致丝裂活性低于可检测水平。抗性细胞的胶原合成率显著增高。结论ＰＤＧＦ－ＢＢ的真核表达系统已得以成功构建，该重组蛋白可促进成纤维细胞增生和胶原合成，提示其在损伤修复中有潜在应用价值     

逆转录病毒介导的基因转移方法的建立

将人促红细胞生成素（ｈＥＰＯ）、人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）、细胞程序死亡抑制基因（ＢＣＬ－２）重组逆转录病毒质粒ＤＮＡ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７后，经Ｇ４１８抗性筛选，其单克隆细胞株培养上清液均具有感染ＮＩＨ３Ｔ３及大鼠原代成纤维细胞、成肌细胞并形成Ｇ４１８抗性克隆的能力。其感染细胞的染色体ＤＮＡＰＣＲ鉴定结果均为阳性，表明其染色体中均成功地整合了目的基因；感染的靶细胞均能表达外源基因编码蛋白，表明已成功地建立了逆转录病毒介导的基因转移技术。     

利用杆状病毒早期启动子在昆虫细胞中持续表达人β－干扰素

在含苜蓿尺蠖核多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）早期基因启动子的载体ｐＡｃＩＥ１中，插入人β－干扰囊（ＨｕＩＦＮ－β）基因，构建成转移载休ｐＩＥ１－ＩＢ；ｐＩＥ１－ＩＢ与含新霉素抗性基因（ＮＥＯ￣ｒ）的质粒ｐＩＥＩ－ＮＥＯ共转染秋粘虫细胞（Ｓｆ９细胞），使ＨｕＩＦＮ－β基因和ＮＥＯ￣ｒ基因整合到细胞基因组上产生转化细胞，含Ｇ４１８的培基分离新霉素抗性克隆，并增殖传代；转化细胞株传至５０代以上，不同传代水平细胞ＤＮＡ的点杂交证实ＨｕＩＦＮ－β基因已整合在细胞ＤＮＡ分子上，同时检测出干扰素（ＩＦＮ）的持续稳定表达，活性为５００—４０００ＩＵ／１０￣６细胞。抗天然ＨｕＩＦＮ－β抗体能完全中和所表达ＩＦＮ的抗病毒活性。     

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ并大肠杆菌中克隆与表达，方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ将其定向插入ＰＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致，以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组于ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ     

人转化生长因子β1基因非翻译区的改造及其全长序列测定

通过ＰＣＲ和体外重组技术对ＴＧＦβ１基因５＇和３＇非翻译区进行了改造，在此基础上，通过构建缺失突变体，采用双脱氧终止法，利用ｐＵＣ／Ｍ１３系统测定了人ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ的全长序列。这为今后研究不同长度非翻译区对ＴＧＦβｃＤＮＡ表达水平的影响并实施其高效表达奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子I基因的人工半合成和克隆

利用固相亚磷酸三酯法化学合成了成人胰岛素样生长因子Ｉ（ＩＧＦ－１）结构基因的４条寡核苷酸片段，然后通过１，２和３，４片段末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ醇促补平成为完整的ＩＧＦ－Ｉ双链ＤＮＡ片段，通过适当的酶切后，克隆于ｐＵＣ－１９中，构建了ｐＵＣＩＧＦ克隆载体，经双脱氧末端终止法测序证明，ＤＮＡ序列与我们所设计的ＩＧＦ序列完全一致。     

HLA—DR基因的克隆及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

获得表达ＨＬＡ－ＤＲ基因的小鼠墨色素瘤细胞，方法应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人Ｂ淋巴瘤细胞Ｒａｊｉ中克隆了ＨＬＡ－ＤＲ３α和β链ｃＤＮＡ，并经测序证实。将其分别插入至真核表达载体ｐＬＸＳＮ和ｐＣＥＰ４中，用脂质体转上鼠黑色素瘤细胞Ｂ１６，然后用Ｇ４１８和Ｈｙｇ双重筛选。     

受电离辐射的细胞中p53介导增殖细胞核抗原表达的调控

增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是一种高度保守的细胞蛋白,在ＤＮＡ复制和修复中起作用。本实验用γ射线照射大鼠胚胎成纤维细胞（ＣＲＥＦ）诱导ｐ５３,研究照射后ＰＣＮＡ表达的机制。方法：实验用ｐＢＡＣＡＴ（其ＰＣＮＡ－氯霉素转移酶报告基因区域内含有人ＰＣＮＡ启动子序列）和ｐＣＭＶ－ＤＭｐ５３（表达突变型ｐ５３蛋白）两种质粒,照前２４小时用磷酸钙介导法将报告质粒转染细胞,６小时后实行甘油休克;转染２４小时后用１３７　Ｃｓγ射线照射ＣＲＥＦ１２Ｇｙ,剂量率为１．２５Ｇｙ·ｍｉｎ－１。照后在４８小时内进行细胞瞬…     

c—myc特异性结合序列增强基因表达的研究

目的：ｃ－ｍｙｃ是一种转录因子，它与其特异性结合序列结合后，可增强下游基因的表达。方法：将４个重复拷贝的ｃ－ｍｙｃ顺式反应元件（ＣＡＣＧＴＧ）４、ＣＭＶ增强子／启动子以及带有ＣＭＶ增强子／启动子的（ＣＡＣＧＴＧ）４分别插入报道基因质粒ｐＢＬＣＡＴ２，得到３种融合报道质粒：ｐＭ４ＣＡＴ２、ｐＣＭＶＣＡＴ、ｐＭ４ＣＭＶＣＡＴ。结果：ＣＡＴ测活表明，在ｃ－ｍｙｃ高表达的ＢＴ３２５细胞中，ｐＭ４ＣＡＴ２的ＣＡＴ活性比ｐＢＬＣＡＴ２增高１０．７倍，而在ｃ－ｍｙｃ低表达的ＨｅＬａ细胞中，仅增高１．１倍；在ＢＴ３２５细胞中，ｐＭ４ＣＡＴ２的ＣＡＴ活性为ｐＣＭＶＣＡＴ的１／４，而ｐＭ４ＣＭＶＣＡＴ的ＣＡＴ活性与ｐＣＭＶＣＡＴ相当。结论：连接了（ＣＡＣＧＴＧ）４的ＴＫ启动子的转录活性依赖于ｃ－ｍｙｃ的扩增情况。而在（ＣＡＣＧＴＧ）４ＴＫ的前面再增加一个强的增强子可进一步增强该启动子的活性。     

人血小板生成素在大肠杆菌中的高效表达

目的：人血小板生成素（ＴＰＯ）在大肠杆菌中的高效表达。方法：利用ＰＣＲ技术,扩增出了（１－１７４个氨基酸的）人血小板生成素ｃＤＮＡ,并将其克隆到ｐＧＥＸ－１λＴ载体中,构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定。表达产物ＳＤＳ－聚丙烯胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。结果：限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的（１－１７４氨基酸）ＴＰＯｃＤＮＡ片段;表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ相对分子质量