荧光定量PCR检测梅毒螺旋体方法的建立及初步应用

目的采用二聚体蝎型探针技术建立一种高敏感性和特异性的检测梅毒螺旋体(TP)的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法根据TP特异性外膜蛋白Gpd的基因序列设计引物和荧光探针,采用基因工程技术构建可用于TP定量的标准品,优化荧光定量PCR的反应体系和反应条件,建立检测TP的二聚体蝎型探针定量PCR。采用本研究建立方法和商品化荧光定量PCR试剂盒检测40例临床标本,对比分析检测结果的统计学差异。结果成功构建了TP重组质粒标准品和TP的二聚体蝎型探针定量PCR,该方法线性范围为101~108 copy/mL,灵敏度为10copy/mL,特异性和敏感性均为100.0%;二聚体蝎型探针定量PCR对疑似梅毒病例阳性检出率显著高于目前商品化Taqman荧光定量PCR试剂盒(82.5%vs 62.5%,P0.05)。结论成功建立了二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测TP的方法,为临床上TP的早期诊断和防控奠定了基础。     

荧光定量PCR检测HCV-RNA的研究进展

荧光定量PCR(FQ-PCR)是近几年来发展起来的可用于检测丙型肝炎病毒(HCV)感染的一种新手段。现介绍目前常用的荧光定量PCR技术,并通过与常规定性PCR和ELISA法的比较阐明该技术对HCV进行定量检测的临床价值。     

荧光定量PCR技术及其在临床上的应用

荧光定量PCR(FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReactionFQ PCR)技术是在 90年代末期发展起来的一项全新技术。经过几年的实践及临床应用 ,已获得了较为稳定的检测效果。作为一种体外基因扩增技术 ,它能敏感地检测初始模板浓度及基因变异等情况。它的出现 ,克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题 ,使得PCR技术更广泛地应用于临床 ,在监测患者病情、预后、指导用药等方面有着广阔的应用前景。本文概述了FQ PCR技术及其在临床上的应用 ,即常见病原体的检测[1,3 ] 及其在分子遗传学和法医学中的应用     

DD3基因实时荧光定量RT—PCR检测前列腺癌特异性方法的建立

目的 建立DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法,为前列腺癌的快速诊断提供分子诊断依据.方法 根据Genebank中的 DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,采用基因重组技术构建用于DD3基因检测的定量标准品;建立DD3基因的实时荧光定量方法.结果 成功构建了用于DD3基因荧光定量PCR检测的标准重组质粒和DD3基因实时荧光定量PCR方法;经稳定性、特异度、重复性和敏感度实验方法学评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1.64 copy/ml,线性范围为1.64～1.64×1012copy/ml.结论 DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法的建立,将为前列腺癌特异性诊断及其临床应用奠定方法学基础.     

人肠道乳酸杆菌的荧光定量PCR定量检测方法的研究

目的应用实时荧光定量PCR技术对健康人粪便内乳酸杆菌进行定量分析,建立乳酸杆菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法依据乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,应用荧光定量PCR技术检测乳酸杆菌的16SrDNA,对粪便中的乳酸杆菌进行定量检测和分析,并和用传统方法所获得的结果进行比较。结果结果显示荧光定量PCR检测乳酸杆菌和传统方法检测乳酸杆菌之间无统计学差异（P〉0.05）。结论荧光定量PCR技术比传统方法特异性高、敏感性强,临床上可用此方法对患者肠道乳酸杆菌进行定量分析。     

定量PCR的研究进展

定量PCR技术是在PCR定性技术基础上发展起来的基因定量技术 ,克服了原有的PCR技术存在的不足 ,能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等。本文就定量PCR技术中的竟争性PCR和荧光定量PCR技术作一综述 ,以便更好地理解及应用这项技术     

荧光定量PCR技术及其临床应用

PCR技术是一种体外核酸扩增技术。通过 PCR技术可对待定基因进行扩增 ,其主要应用领域是基因检测和临床基因诊断。但其应用于临床基因诊断还存在许多局限性 ,主要表现在不能准确定量和因交叉污染而易产生假阳性等。荧光定量 PCR(Fluoresence Quantive Polymerase ChainReaction,FQ- PCR)的出现 ,解决了上述问题 ,是 PCR技术的革命性进展。它可以定量分析 DNA或 RNA样本的拷贝数 ,准确检测出样品中的基因数目 ,在临床实践中有着重要的意义和应用前景。FQ- PCR基于荧光共振能量转移 (Fluoresence Reso-nance Energy Transfer,…     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

荧光定量PCR在妊娠晚期B族链球菌感染检测中的应用及GBS感染对妊娠结局的影响

目的探讨荧光定量PCR技术检测妊娠晚期孕妇B族链球菌(GBS)感染的临床价值,及GBS感染对妊娠结局、新生儿的影响。方法收集2017年1月～2018年1月568例在我院产检的孕35周以上的孕妇阴道分泌物,采用细菌培养法及荧光定量PCR法检测GBS感染情况,其细菌培养出GBS为诊断金标准;再根据荧光定量PCR技术检测GBS感染情况分为GBS阳性组、GBS阴性组,比较两组的妊娠结局及新生儿健康状况。结果 568例孕妇中55例带菌者,GBS携带率为9.68%;52例孕妇细菌培养和实时荧光定量PCR技术检测均阳性,495均为阴性,3例细菌培养阳性而实时荧光定量PCR技术检测阴性,18例细菌培养阴性而实时荧光定量PCR技术检测阳性,其灵敏度为94.54%、特异度为96.49%、准确度为96.30%;与GBS阴性组比较,GBS阳性组妊娠不良结局及新生儿身体疾患的发生率显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论荧光定量PCR法可用于妊娠晚期孕妇GBS的检测,进行早期干预,可改善妊娠结局及新生儿健康状况。     

荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用价值

目的探究荧光定量PCR,技术在临床微生物检测中的应用效果。方法回顾性分析2017年1月-2019年1月间我院门诊收治的90例患者的临床标本,对其荧光定量PCR技术微生物检测结果进行分析。结果各取2株沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、副溶血性弧菌及黄色葡萄球菌进行试剂盒特异性检测,结果未出现假阳性或假阴性情况,特异性100%;同时对所取菌株进行10倍系列系数PCR技术灵敏度检测,结果表明102拷贝/mL核酸样本能够进行最低核酸检测限度。结论在微生物的临床检测中,荧光定量PCR技术灵敏度强,特异性好,检测效率高,还具有精准的特点,值得推广应用。     

定量PCR的研究进展

定量PCR技术是在PCR定性技术基础上发展起来的基因定量技术，克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等。本文就定量PCR技术中的竞争性PCR和荧光定量PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。     

基于CRISPR-Cas13a技术的乙型肝炎病毒ccDNA检测方法临床应用评价

摘要:目的评价基于CRISPR-Cas13a技术的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(ceDNA)检测方法的应用价值。方法收集25例HBV感染患者和5例非HBV感染患者的肝组织标本,提取肝组织的总DNA,依次使用HindII内切酶和质粒安全 性ATP依赖DNA酶(PSAD)消化;设计HBV cceDNA的特异性引物,扩增消化后的产物;利用CRISPR/Cas13a技术建立CRISPR-HBV cceDNA检测方法,通过HBV cceDNA质粒和临床样本对该方法进行评价,并利用数字PCR和荧光定量PCR方 法进行比较。结果本研究建 立的方法检测HBV cccDNA质粒的灵敏度为1 copies/μL,显著高于数字PCR( 10 opies/μL,P<0.01)和荧光定量PCR( 10'' copies/uL,P<0.01);建立的方法检测HBV cceDNA阳性样本的灵敏度为1 copies/uL,与数字PCR 相同,高于荧光定量PCR( 10 copies/ μL,P<0.01);建立的方法对25例HBV感染的临床肝组织样本的检出阳性率为80%,均高于数字PCR(64%)和荧光定量PCR(48%)。结论本研究 建立的CRISPR-HBV cceDNA检测方法在乙肝患者肝组织标本 HBVcccDNA检测中具有较高的灵敏度,为评价乙肝患者的临床治疗效果和监测停药复发等情况提供了有效帮助。     

终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床应用

目的运用终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA,探讨其临床应用价值。方法运用本研究组制备的引物和荧光探针分别将HBV-DNA质粒及临床标本进行普通PCR和实时荧光定量PCR反应,再将普通PCR产物在荧光测定仪上测定荧光强度,与实时荧光定量PCR结果相比较,观察其符合程度。另外,运用相同方法比对本研究制备的PCR体系与市售荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的符合程度。结果终点法荧光定量PCR与实时荧光定量PCR检测HBV-DNA质粒及临床标本结果一致(P>0.05),与市售荧光定量PCR试剂比较,其符合程度较高(P>0.05)。结论终点法荧光定量PCR检测临床HBV-DNA标本稳定可靠,可作为荧光定量PCR的应用方法之一在基层医院推广应用。     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究

目的建立金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR的快速检测方法,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据金黄色葡萄球菌femB基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于金黄色葡萄球菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的方法。结果成功构建了金黄色葡萄球菌重组质粒标准品和金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性试验,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;将模拟标本与分离培养对比,两者符合率为100%。结论金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为金黄色葡萄球菌感染诊断及食源性金黄色葡萄球菌污染的快速检测提供依据,可用于临床感染诊断及食品卫生监管、商品检验检疫等。     

350例血清乙肝HBV-DNA检测结果分析

荧光定量PCR技术是目前基因诊断中的一个重要手段,因其灵敏度高,特异性强,特别是它采用了荧光技术和闭管检测,克服了常规PCR方法中只有定性而无法定量,假阳性率高,以及紫外线对工作人员的严重伤害等缺点,因而在临床中得到了广泛的应用.     

新型荧光定量PCR检测孕妇生殖道解脲脲原体方法的建立

目的 探讨建立自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测解脲脲屏体（Uu）的可行性及价值。方法 根据Uu UreA基因序列设计合成引物和自身淬灭引物,采用基因克隆技术,将UreA基因片段插入到载体pMD18-T,以此作为标准品。优化PCR条件,建立以自身淬灭引物技术为平台的实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法,并对所建立的方法进行初步方法学评价。结果 成功构建了重组质粒pMD18-T-UreA;建立了以自身淬灭探针技术为基础的实时荧光定量PCR方法,其线性检测范围为10^1～10^9copies／μl;灵敏度为10copies／μl;重复性实验批内CV为2．35％,批间CV为3．68％,天间CV为4．92％;特异性好;通过初步临床应用发现,所建立的FQ-PCR方法与经典的培养方法相比,不仅能实时监测反应进程、绝对定量和快速检测,且检出率显著高于培养方法。结论自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测Uu具有快捷、敏感、廉价等优点,可在临床诊断中应用。     

实时荧光定量RT-PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT—PCR）技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测。为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域,本文就荧光定量RT—PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸（mRNA）存在的几个问题,以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述。     

荧光定量聚合酶链反应检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-1方法的建立

目的　构建含有金属蛋白酶组织抑制因子- 1(TIMP -1)的重组质粒并以其为模板建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测TIMP- 1的标准曲线,为荧光定量PCR准确检测TIMP- 1奠定基础。方法　提取大鼠星状细胞系HSC -T6的mRNA,经RT- PCR扩增TIMP- 1基因后与pGMT Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,以筛选得到的阳性克隆质粒作为标准品进行梯度稀释,分别用Taqman荧光探针技术和SYBRGreenI荧光染料技术进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对两者结果进行了对比。同时进行普通PCR检测,与荧光定量PCR方法检测结果进行比较。结果　重组质粒经PCR扩增及序列测定,表明pGMT- TIMP- 1基因已成功克隆。以不同稀释水平的标准品质粒进行荧光定量PCR扩增, 应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线的线性检测范围为7×104 ~7×108 拷贝,检测灵敏度为7×104 拷贝;应用SYBRGreenI荧光染料技术的线性检测范围为7×106 ~7×108拷贝,检测灵敏度为7×106 拷贝,且熔解曲线显示出现非特异性扩增;两种技术相对于普通PCR技术均具有定量功能。结论　所构建的pGMT- TIMP -1基因荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好, 灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为荧光定量PCR检测TIMP -1基因的标准方法。     

荧光定量PCR技术检测结核分支杆菌DNA的应用价值

目的评价荧光定量PCR技术检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法应用荧光定量PCR法及抗酸染色、结核杆菌培养法,对179例活动性肺结核患者晨痰、123例活动性肺结核患者外周血、34例结核性胸膜炎患者胸水、20例非结核性呼吸系统疾病患者的晨痰标本进行检测。结果179例活动性肺结核患者晨痰、123例活动性肺结核患者外周血、34例结核性胸膜炎患者胸水,涂片抗酸染色阳性率分别为20．67％（37／179）、0．00％、0．00％;细菌培养阳性率分别为41．34％（74／179）、0．00％、2．94％（1／34）;荧光定量PCR技术阳性率分别为64．25％（115／179）、38．21％（47／123）、44．12％（15／34）。3种标本荧光定量PCR技术阳性率高于抗酸染色和结核杆菌培养,经统计学处理发现,差异有统计学意义。用荧光定量PCR技术检测临床标本特异性为95．00％。结论荧光定量PCR技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,在单一管内完成,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性高等优点,是结核病诊断的有效方法之一。     

2种高通量核酸检测方法多种呼吸道病原体检测效能比较

目的比较多重荧光定量聚合酶链反应(PCR)和TaqMan微流体芯片(TAC)技术检测呼吸道病原体的效能。方法收集419例急性呼吸道感染患者临床样本,分别采用TAC技术和多重荧光定量PCR进行多种呼吸道病毒核酸检测,比较2种方法的敏感性和特异性。结果多重荧光定量PCR多种呼吸道病毒的阳性检出率为30.1%,敏感性为93.4%,特异性为98.9%;TAC技术多种呼吸道病毒阳性检出率为27.9%,敏感性为87.4%,特异性为98.9%。2种方法检测结果的一致性为92.8%,且敏感性和特异性差异均无统计学意义(P0.05)。结论 TAC技术与多重荧光定量PCR检测常见呼吸道病毒的敏感性和特异性相近,但TAC技术检测病原谱范围更广,在紧急情况下可作为快速筛查多种呼吸道病原体的有效方法。