多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法

目的 建立一种快速鉴定和鉴别五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法.方法 利用五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因stx1、stx2、eaeA、lt、stIb、aggR、ipaH及16S rRNA基因rrs,建立8重PCR反应体系,并对PCR引物、反应体系和循环条件进行优化.结果 8对PCR引物均能特异地扩增相...     

儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的检测

目的了解儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的感染情况。方法对95份腹泻患儿粪标本中分离出的大肠埃希菌,用荧光聚合酶链反应（PCR）的方法检测毒力基因,鉴定致泻性大肠埃希菌。结果检测出15株阳性菌株,阳性率为15．8％,其中肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）6株、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）4株、弥散聚集性大肠埃希菌（DAEC）4株和肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）1株。结论致泻性大肠埃希菌是引起儿童腹泻的主要致病菌,临床实验室应加强对致泻性大肠埃希菌的检测。     

弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况

目的 建立一种快速检测弥散黏附性大肠埃希菌（DAEC）的普通多重PCR方法,了解DAEC在腹泻患者中的流行情况。方法 根据DAEC黏附基因afaB、afaC、afaD、daaE及16S rRNA基因rrs,建立4重PCR反应体系,对PCR引物、反应体系和反应条件进行优化,评价敏感性和特异性,并应用于389份腹泻患者粪便标本的筛查。结果 4重PCR反应可以特异性扩增DAEC菌株afaB/C、afaD、daaE基因片段,除2株肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）外,检测引物对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌均无特异性扩增,此多重PCR方法的检测下限可达3.20 101 CFU/反应（8.01 103 CFU/ml）。利用本研究建立的多重PCR方法对腹泻患者粪便标本进行检测,发现DAEC菌株分离率为6.2%（24/389）。结论 本研究建立的多重PCR方法可用于DAEC菌株的快速鉴别,也可用于人粪便标本DAEC的初步筛查。     

长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌实时荧光多重PCR检测结果分析

目的了解长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌感染、分布及毒力基因携带情况。方法抽取长沙市9个单位258例食品从业人员为研究对象,采用实时荧光多重聚合酶链反应(PCR)检测致泻大肠埃希菌。结果致泻大肠埃希菌感染率为15.5%(40/258),其中肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)占10.9%(28/258),肠致病性大肠埃希菌(EPEC)占3.1%(8/258),肠出血性大肠埃希菌(EHEC)占1.6%(4/258),未检出肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)。28株EAEC携带uidA基因26株,aggR+pic基因13株,astA基因27株,携带率分别为92.9%、46.4%、96.4%;8株EPEC全部携带eae和uidA基因;4株EHEC中3株携带eae基因,且都携带stx1+stx2基因。结论建立持续监测致泻大肠埃希菌的机制和深入研究其分子流行病学理论,除了为监管部门制订和评价公共卫生措施提供基础数据,对评价食品安全状况,有效控制传染源、保护人民群众健康具有重要意义。     

致泻性大肠埃希菌病原学分布研究

[目的]通过调查大肠埃希菌在自然环境中的病原学分布,了解对环境污染的途径和对人群造成的危害,为预防和控制致泻性大肠埃希菌的传播提供依据。[方法]所有样品均按GB4789．6-94方法进行。对阳性菌株进行毒素、毒力以及药敏试验,为临床诊断及提高疗效提供指导。[结果]共检测886份样本,检出103株阳性菌,阳性率为11．63％,其中EPEC7l株,分属11个血清型,阳性率为8．0l％;EIEC26株,分属6个血清型,阳性率为2．93％;ETEC5株分属3个血清型,阳性率为0．56％;EHEC(O157H7)l株阳性率为0．1l％。[结论]初步研究证实了EPEC是发布于本地区自然环境中的主要菌群,其次是EIEC、ETEC、EHEC、EHE在河北省区域内首次从鸡肠内容物中检出,证实了鸡为我省区域内携带O157H7出血性大肠杆菌的动物之一。药物敏感试验提示头孢哌酮(Cefoperaxone)、亚胺硫霉素(Imipenem)、妥布霉素(Tobramycin)、新霉素(Neomycin)可作为本地区治疗由致泻性大肠杆菌引发腹泻的首选药物。     

致泻性大肠埃希菌自然环境分布初探

[目的]通过石家庄市区、正定、赞皇三个自然区域的食品、土壤、水体、家畜、家禽的粪便及鸡肠腔内容物、苍蝇体表等样品进行致泻性大肠埃希菌的调查,初步掌握致泻性大肠埃希菌在自然环境中的生态分布,了解其对环境污染的途径和对人群造成危害的因素,为预防和控制致泻性大肠埃希菌的传播提供依据。[方法]所有样本均按GB4789．6-94方法进行分离鉴定。[结果]共检测样品886,检出阳性菌株89株,阳性率为10．05％,其中EPEC 71株,阳性率8．01％,EIEC l3株,阳性率1．47％,ETEC 5株,阳性率0．56％。[结论]初次证实了EPEC、EIEC、EIEC是本地区分布于自然环境中的主要菌群,其中EPEC为优势菌。     

快速检测大肠埃希菌LAMP方法的建立

目的 建立一种环介导等温扩增(LAMP)反应快速检测大肠埃希菌的方法。方法 根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)上大肠埃希菌的lacZ(登录号:M74750)基因序列,设计4条特异引物(2条内引物,2条外引物),对lacZ基因进行扩增,对扩增反应进行优化,采用琼脂糖电泳及肉眼观察结果。结果 将提取的13株细菌DNA进行LAMP反应,仅大肠埃希菌得到阳性结果,LAMP检测下限为15cfu/mL。结论 LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法,适合临床开展。     

Identification of human enterovirulent Escherichia coli strains by multiplex PCR

Some strains of Escherichia coli are involved in enteric infections in both adults and children. However the classical diagnostic methods can not differentiate pathogenic from nonpathogenic E. coli, because of the lack of phenotypic differences. In this study, we developed multiplex PCR in order to amplify fragments of specific virulence genes of the five main E. coli pathotypes. Fragments of the expected size were obtained using previously or newly designed primers and allowed identification of 10 virulence genes in only 5 reactions. This method was applied to the detection of pathogenic E. coli isolated from 90 patients' stools specimens during an 18-month survey. Patients were suffering from diarrhea or hemolytic uremic syndrome and in 13 cases (14.4%), an enterovirulent E. coli strain was detected. This diagnostic method could therefore represent an important technique in clinical laboratories which lack standard tests for these pathogens.     

多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因

目的 建立多重实时PCR检测志贺毒素（stx1、stx2）基因和紧密素基因（eae）的方法。方法 优化多重实时PCR反应条件，检测系列稀释的阳性菌DNA提取物及纯化阳性质粒。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌株，并比较其阳性和阴性符合率。对比3种粪便样品处理和DNA提取方法，选出最适方法。同时用该方法对36份腹泻患者粪便标本进行直接检测且对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10^1拷贝／pJ的毒力基因和10。CFU／p．1的DEL933大肠埃希菌。检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌的阳性和阴性符合率均为100％。粪便样品的DNA提取以BP肉汤增菌6h后煮沸提取效果最好。36份腹泻患者粪便中2份eae阳性，均鉴定为大肠埃希菌。结论 建立的同时检测stx1、stx2、eae基因的多重实时PCR方法，具有较高的敏感性，可用于产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）和肠致病性大肠埃希菌（EPEC）毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。     

Detection of virulence factors of Escherichia coli from children by multiplex polymerase chain reaction

A total of 161 Escherichia coli (E. coli) strains isolated from children with urinary tract infection (UTI) were analysed for the genes encoding the virulence factors such as pyelonephritis (pap), s fimbriae (sfa), afimbrial adhesin I (afaI), haemolysin (hly), cytotoxic necrotising factor I (cnf I) and aerobactin (aer) by multiplex PCR. Ninety-four E. coli strains were found to carry at least one virulence factor. Therefore, 58.38% of total population was positive for one virulence gene at least. Percentage of genes within the total population for pap, sfa, afaI, hly, cnf I and aer was found as 22.98, 6.21, 9.94, 1.24, 9.94 and 39.75, respectively. Our analysis showed that sfa-pap (p < 0.001); pap-aer, afaI-aer and cnf I-pap (P < 0.05) and hly-sfa (p < 0.01) significantly co-occurred in their respective samples. In the light of these findings, we suggest an important role of pap causing UTI.     

多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌中氨基糖苷类抗生素耐药基因及其临床应用

目的 建立金葡菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的多重PCR快速检测体系,了解耐药基因acc(6')-Ie+aph(2″)、aph(3')-Ⅲat ant(4')-Ia在广州地区的流行分布.方法 采用VITEK-60或PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定菌株及药敏试验,利用琼脂扩散法检测4种氨基糖苷类抗生素的耐药表型.通过优化PCR体系建立多重PCR并应用于检测金葡菌氨基糖苷类抗生素耐药基因.结果 构建了四重PCR快速检测体系, 124株金葡菌临床分离株中,acc(6')-Ie+aph(2″)、aph(3')-Ⅲa和ant(4') -Ia的检出率分别为62.1%、32.3%和1.6%;所有庆大霉素、奈替米星以及阿米卡星耐药的金葡菌菌株均检测到上述3个耐药基因中的1个或1个以上基因;74株mecA阳性菌株中72株(97.3%)检测到acc(6')-Ie+aph(2″) 基因.结论 所构建的多重PCR检测体系为临床实验室提供快速而有效的菌株耐药基因检测手段.编码AAC(6')-APH(2″)双功能酶的acc(6')-Ie+aph(2″) 基因是金葡菌最重要的氨基糖苷类抗生素耐药基因,其次为aph(3')-Ⅲa,ant(4')-Ia则少见.     

The usefulness of multiplex PCR for the identification of bacteria in joint infection

Background: The diagnosis of septic arthritis (SA) relies on synovial analysis and conventional culture. But, these methods lack of sensitivity and culture is time consuming to establish a definite diagnosis. This study evaluated a new multiplex PCR assay which entailed screening PCR for Gram typing and identification PCR for species identification using two primer mixes. Methods: A total of 80 synovial fluid samples from patients with suspected SA were collected. Culture, multiplex PCR, and 16S rRNA gene PCR were performed. Results: The analytical sensitivity of multiplex PCR assay was 10¹ CFU/ml for each type of bacteria. There was no cross‐reactivity with common bacterial pathogens. Bacteria were detected in 20, 25, and 26 of 80 samples for culture, multiplex PCR, and 16S rRNA gene PCR, respectively. Nineteen (95%) of 20 culture‐positivesamples and 6 (10%) of 60 culture‐negative samples were positive for the multiplex PCR. Five of six samples which were positive only from multiplex PCR were also positive in 16S rRNA gene PCR. The multiplex PCR showed 2 false‐negative in 27 true‐positive samples but no false‐positive. The sensitivity and specificity of the multiplex PCR were 92.6 and 100%, and the agreement with culture and 16S rRNA gene PCR were 91.3 and 96.3%, respectively. The time to detection for multiplex PCR was a maximum of 6 hr. Conclusion: This multiplex PCR assay offers high sensitivity and improved detection speed relative to culture. The appropriate combination of this new multiplex PCR assay with culture may contribute to the accurate and rapid diagnosis of SA. J. Clin. Lab. Anal. 24:175–181, 2010. © 2010 Wiley‐Liss, Inc.     

浙江省衢州市应用聚合酶链反应检测钩端螺旋体效果评价

目的 建立聚合酶链反应(PCR)检测钩端螺旋体的快速方法,应用于宿主动物钩端螺旋体的快速检测,同时比较PCR方法和常规检测的效果.方法 根据中国疾病预防控制中心提供的引物,以致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶藻弧菌、沙门菌、霍乱弧菌、痢疾志贺菌、非O1、O139霍乱弧菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7为对照,建立PCR检测钩端螺旋体的快速方法,用于钩端螺旋体的快速检测.结果 衢州市2006年分离钩体菌株进行PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符.100只鼠和100只蛙肝、脾、肾标本进行PCR检测,PCR检测阳性率10%,钩体菌株培养分离率仅为1%,二者差异有统计学意义(2=16.05,P0.005).结论 PCR检测钩端螺旋体灵敏度高、特异性强,可用于钩端螺旋体的快速检测.     

大理地区志贺菌的血清型分布及多重PCR检测技术的应用

目的 探讨大理地区志贺菌的血清型分布以及多重PCR技术在志贺菌检测中的应用.方法 用常规分离培养、生化鉴定和血清学分型法对腹泻患者粪标本进行检测,分离到的标本再用多重PCR法对志贺菌的毒力基因shetA、shetB、ial和ipaH进行扩增检测.结果 通过常规培养和生化反应鉴定,得到68株志贺菌.血清学鉴定显示福氏志贺菌41株,宋内志贺菌25株,鲍氏志贺菌2株.通过多重PCR扩增后68株志贺菌均在423 bp(ipaH)处出现了条带,检出率为100%,其余在147 bp(shetB)、309 bp(shetA)处以及320 bp(ial)处均出现了至少一个条带,与常规鉴定法的符合率达100%.5份直接用阳性粪便标本提取DNA为模板进行多重PCR扩增后,也得到了同样的结果.结论 大理地区细菌性痢疾患者感染以福氏志贺菌为主,多重PCR技术可用于志贺菌的快速检测和流行病学调查.     

聚合酶链反应检测出血性大肠埃希菌

为建立一种针对出血性大肠埃希菌的特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，根据Ｏ１５７：Ｈ７血清型大肠埃希菌ｈｌｙＡＢ基因的ＤＮＡ序列，设计８个引物，使用３２株Ｏ１５７：Ｈ７血清型。结果表明，引物ＲＨ２８－ＲＨ３０和ＲＨ２６－ＲＨ３１敏感性和特异性好，达１００％。ＲＨ２６－ＲＨ３１产物的分子量较大，为２ｋｂ。ＲＨ２８－ＲＨ３０的产物为３３８ｂｐ，比较适合检验使用。研究还发现，使用煮沸法制备ＰＣＲ模板，方法简便、快速、实用，且对ＰＣＲ反应的特异性和敏感性无影响。ｈｌｙＡＢ基因片段作为出血性大肠埃希菌ＤＮＡ探针的特异性和敏感性是明显的，且实用性好。根据出血性大肠埃希菌独特的ｈｌｙＡＢ基因序列设计的ＰＣＲ引物，在理论和实际应用方面均有其优越性。