人白细胞介素1β通过caspase途径诱导人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡

目的:对interleukin-1β(IL-1β)诱导人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡的信号转导途径进行研究。方法:使用倒置显微镜观察细胞形态学变化。通过MTT法测定IL-1β对A375-S2细胞的抑制作用以及细胞内半胱氨酸蛋白酶(caspases)与这种作用的关系。利用乳酸脱氢酶(LDH)测定法对IL-1β作用后细胞的损伤情况进行分析。琼脂糖凝胶电泳法检测IL-1β对细胞DNA降解的影响。结果: IL-1β对A375-S2细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性,在10^-9mol/L作用72 h时达到90%以上。caspase-1、-3、-8、-9和caspase-10的抑制剂能够部分抑制IL-1β早期诱导的细胞凋亡。 LDH活力测定显示,在IL-1β诱导的细胞死亡过程中,凋亡占主导地位,并呈现剂量和时间依赖性 。细胞经过10^-11mol/L IL-1β处理72 h后,出现凋亡典型的DNA梯状条带,与上述结果一致。 结论: IL-1β能够诱导人黑色素瘤A375-S2细胞凋亡,这种作用可能依赖于激活一类介导凋亡的caspase家族蛋白酶。     

水飞蓟素对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用

目的：探讨水飞蓟素(SIL)对同型半胱氨酸(HCY)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的抑制作用及其作用机制。方法:采用MTT及LDH检测细胞活性,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化,并用荧光酶标仪测定caspase-3,-6,-9的活性。Westernblotting分析相关蛋白的表达。结果:1mmol/LHCY使HUVECs的存活率比对照组低79.5%(P<0.01),5-20μg/LSIL明显抑制HCY所致的HUVECs死亡(P<0.05,P<0.01),20μg/LSIL可使HUVEC的存活率恢复到对照组的83.7%。HCY刺激后Bcl-2与XIAP的表达显著低于对照组,Bax的表达显著高于对照组,20μg/LSIL可使Bcl-2凋亡蛋白的改变发生逆转。SIL可明显抑制1mmol/LHCY引起的caspase-3、caspase-6、caspase-9的升高。SIL明显抑制1mmol/LHCY引起的Δψm下降和CytoC、Smac及AIF的释放。结论:SIL能抑制HCY诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,其细胞保护作用可能与降低细胞内活性氧水平,抑制caspase-3,-6,-9的活性和维持线粒体膜电位的高能状态有关。     

吴茱萸碱诱导A375-S2细胞死亡过程中对ERK激酶的调控

目的:对比吴茱萸碱与化疗药物对A375-S2细胞的细胞毒活性,并且研究PKC及ERK激酶在吴茱萸碱诱导A375-S2细胞死亡中的作用。方法:MTT法,Western印迹法。结果:虽吴茱萸碱对A375-S2细胞毒作用比化疗药物放线菌素D、顺铂和5-氟尿嘧啶弱,但对药物撤除后细胞继续增殖能力的影响远胜于3种化疗药物。低浓度(10μg/L)佛波酯(PMA)引起的PKC的激活可部分抑制吴茱萸碱引起的细胞死亡,PKC及ERK抑制剂可逆转这种作用,而且吴茱萸碱减少了ERK蛋白表达,并降低了ERK的磷酸化水平。结论:吴茱萸碱对A375-S2细胞的细胞毒作用即使在药物撤除后仍对细胞继续增殖能力产生抑制作用。吴茱萸碱可通过减少ERK及磷酸化ERK的蛋白表达而阻断ERK激酶对细胞的保护作用。     

藏红花素诱导卵巢癌HO-8910细胞凋亡的体外实验

目的 探讨藏红花素(crocin)诱导卵巢癌HO-8910细胞凋亡及其作用机制.方法 MTT法分析藏红花素对卵巢癌HO-8910细胞增殖的影响;流式细胞仪检测藏红花素作用于卵巢癌HO-8910细胞后,细胞周期分布及凋亡率的改变;Western印迹法检测p53、Fas/APO-1和Caspase-3蛋白的表达.结果 MTT实验分析显示,藏红花素明显抑制卵巢癌HO-8910细胞生长;流式细胞仪检测结果显示,藏红花素作用于卵巢癌HO-8910细胞后,G0/G1期细胞数比例及细胞凋亡率升高.Western印迹法检测结果显示,p53和Fas/APO-1蛋白表达水平明显增加,Caspase-3活性增强.结论 藏红花素能明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的生长,使其被阻滞于G0/G1期,并可能通过上调p53、Fas/APO-1蛋白表达水平,进而激活Caspase-3调控的凋亡途径,从而促进卵巢癌HO-8910细胞凋亡.     

臭灵丹中黄酮类化合物对人喉癌细胞Hep-2凋亡的影响及机制

目的:探讨中药臭灵丹中黄酮类化合物诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的机制。方法:MTT法检测分离自臭灵丹的黄酮类化合物3,5-二羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮(HTMF)对2种正常细胞的毒性和对3种肿瘤细胞株的增殖抑制作用;采用流式细胞仪检测化合物对Hep-2细胞凋亡率的影响;Western blotting法检测凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的变化。结果:HTMF显著抑制Hep-2细胞的增殖并呈浓度、时间双重依赖性关系,但对正常细胞Vero和EVC304的毒性较小,对A549和HepG2细胞抑制作用小。流式细胞仪检测结果显示HTMF对Hep-2细胞有促凋亡作用并呈明显的量效、时效关系。Western blotting结果显示HTMF可诱导Hep-2细胞中caspase-3和caspase-9蛋白的活化,并呈时间依赖性关系。结论:HTMF对人喉癌细胞Hep-2的生长有显著的抑制作用,其机制可能通过激活caspase-9进而活化caspase-3诱导Hep-2细胞凋亡。     

半胱天冬酶天然抑制剂与细胞凋亡

在生物体内,细胞增殖与细胞凋亡总是处于动态平衡状态,从而保证了多细胞生物维系其结构稳定和内环境功能平衡及正常生长发育。正常的细胞凋亡可清除体内衰老的、磨损的或已完成功能的细胞,如胚胎细胞、胸腺细胞等;并能清除具有潜在危险的畸变细胞,如自身反应性淋巴细胞、突变细     

水飞蓟宾-磷脂酰胆碱复合物诱导HepG2细胞凋亡研究

目的研究水飞蓟宾-磷脂酰胆碱复合物（Silybin-phosphatidylcholine Compound,SPC）诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用及其机制。方法不同浓度SPC处理肝癌HepG2细胞,通过MTT法、细胞形态学观察、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察SPC对HepG2细胞的生长抑制作用及其细胞凋亡的影响。结果SPC可抑制HepG2细胞的增殖。其GI50为46．8μg/ml;50μg／ml的SPC作用HepG2细胞24h后,细胞出现早期调亡的形态;75μg／ml、100μg／ml的SPC对HepG2细胞凋亡率分别为（17．22&#177;3．45）％和（25．50&#177;5．72）％;50μg／ml、75μg／ml、100μg／ml的SPC作用于HepG2细胞24h后,细胞内的Ca^2＋浓度显著升高（P〈0．05,P〈0．01）。结论SPC能够诱导肝癌细胞系HepG2细胞凋亡,其机制与SPC升高细胞内Ca^2＋浓度有关。     

细菌氧化还原蛋白azurin诱导U2OS细胞凋亡过程中caspase-3的活化

目的:探讨细菌氧化还原蛋白azurin诱导人骨肉瘤细胞U2OS凋亡过程中是否有caspase-3的活化。方法:Annexin-V/PIFCM检测细胞凋亡情况,用Westernblot分析caspase-3酶原的变化,半定量RT-PCR检测caspase-3mRNA水平的改变,比色法测定caspase-3的相对活性。结果:用0、25、50、100、200mg/Lazurin处理U2OS细胞24h,随药物浓度的增加,caspase-3酶原的蛋白水平减少,caspase-3的mRNA水平增加(P<0.01)。用100mg/Lazurin分别处理细胞3、6、12、24、48h,caspase-3活性于6h开始升高,24h达高峰(为对照组的7.2倍,P<0.01),48h仍高于对照组(P<0.01);用不同浓度的azurin处理细胞,caspase-3活性呈浓度依赖性升高。结论:Azurin诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡过程中有caspase-3的活化,caspase-3在azurin诱导的骨肉瘤细胞凋亡机制中发挥了重要的作用。     

Caspase-9抑制剂对RCS大鼠感光细胞凋亡抑制作用的研究

目的：采用Z-LEHD-FMK进行体内实验,观察caspase-9抑制剂对RCS大鼠感光细胞凋亡的抑制作用。方法：32只18dRCS大鼠随机分4组,检查ERG后随机选择一眼为实验眼给予玻璃体内注射Z-LEHD-FMK4μg,对侧眼给予4μg2%DMSO作对照。各组分别在术后2d、7d、12d、17d行ERG检查,然后摘取双眼球,石蜡切片行HE染色及感光细胞凋亡的TUNEL检测,透射电镜观察视网膜超微结构。结果：实验眼注药后7dERGb波振幅达到最大(137.35±7.41)mV,17d时b波振幅为(57.91±9.27)mV,对照眼7d及以后各组ERG接近熄灭型;实验眼注药后12d视网膜外颗粒层才开始出现凋亡阳性细胞,17d更明显,对照眼强荧光的凋亡阳性细胞在术后7d已经很明显;光镜下注药后17d实验眼感光细胞外颗粒层细胞数尚保持有7-8层,对照眼仅余下2-4层细胞,视网膜厚度变薄;透射电镜下实验眼注药后17d可见部分感光细胞胞核、核仁固缩,对照眼从术后7d开始见感光细胞呈现凋亡改变。结论：Z-LEHD-FMK能够延缓RCS大鼠感光细胞凋亡,合适的caspases抑制剂在适宜的时机应用对视网膜感光细胞凋亡具有一定的抑制作用。     

氧化应激诱导HepG2肝癌细胞凋亡的研究(英)

目的：直接暴露细胞于活性氧能诱导发生凋亡,本文研究氧化应激诱导HepG2肝癌细胞的死亡及其机制。方法：暴露细胞于2mmol/L过氧化氢产生氧化应激,用DNA凝胶电泳检测细胞凋亡,用荧光染色法检测细胞线粒体膜电位变化,Westernblotting检测细胞浆中细胞色素c变化,fluorometricassaykit检测caspase活性变化。结果：氧化应激作用于HepG2细胞后12h开始发生凋亡;氧化应激作用后4h,细胞线粒体膜电位明显下降;胞浆中细胞色素c浓度呈时间依赖性增高;氧化应激作用8h、12h后细胞内caspase-3、caspase-9活性分别升高6.7及3.6倍,但caspase-8活性无变化。结论：氧化应激能诱导HepG2肝癌细胞发生凋亡,其途径与线粒体通路及caspase激活有关。     

紫外线对角质细胞线粒体功能及凋亡的影响研究

目的：分析紫外线（UV）照射对HaCaT角质细胞系线粒体功能及凋亡的影响。方法：以紫外线低剂量（UVA2J/cm2,UVB10mJ/cm2）和高剂量（UVA6J/cm2,UVB30mJ/cm2）照射HaCaT细胞,继续培养15h,用流式细胞仪检测线粒体膜电位（△ψm）、线粒体质量（mitochondrialmass）;使用碘化丙啶（PI）进行DNA染色并用流式细胞仪检测亚二倍体分析凋亡,以及进行AnnexinV-FITC与PI共染色,用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果：HaCaT细胞经紫外线照射后,△ψm下降的细胞比例随着照射剂量的增加而增加,对照组、低剂量组及高剂量组分别为7.94%±1.02%、25.87%±4.55%、39.27%±5.32%;线粒体质量降低的细胞比例同样随着照射剂量的增加而增加,对照组、低剂量组以及高剂量组分别为15.19%±1.58%、40.36%±4.41%、68.79%±5.46%。用PI检测DNA含量所产生的亚二倍体峰观测凋亡率,对照组、低剂量组以及高剂量组凋亡率分别为1.82%±0.51%、30.16%±5.47%、58.49%±5.98%。用AnnexinV-FITC/PI染色分析细胞凋亡程度,其结果与PI-DNA染色所得结果一致,对照组仅有少量细胞死亡,低剂量组凋亡细胞较对照组为多（AnnexinV-FITC单阳性细胞）,高剂量组以坏死细胞为多（AnnexinV-FITC/PI双阳性）。结论：HaCaT细胞经紫外照射后,线粒体去极化作用增强,同时线粒体质量降低,这些变化与细胞凋亡相关。     

p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在紫外线诱导表皮细胞凋亡中的作用

大量流行病学调查及分子生物学实验研究表明：紫外线可通过诱导活性氧及细胞因子产生DNA损伤和基因表达的改变导致细胞凋亡,这个过程非常复杂,有多个信号转导途径参与.由于细胞凋亡与皮肤癌的发生密切相关,近年来UVB诱导表皮细胞凋亡引起了人们广泛的关注.p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是细胞内重要的信号传导系统之一,参与细胞生长、发育、分化和凋亡等一系列生理、病理过程.p38MAPK可被紫外线激活,并在紫外线诱发的细胞应答过程中发挥重要的作用.     

去甲斑蝥素通过半胱氨酸天冬氨酸酶诱导HeLa细胞凋亡

目的：研究去甲斑蝥素（NCTD）通过半胱氨酸天冬氨酸酶（caspase）途径诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的机制。方法：采用MTT法、形态学观察、DNA凝胶电泳、乳酸脱氢酶（LDH）检测及Westernblot检测法。结果：去甲斑蝥素能显著诱导HeLa细胞发生凋亡,caspase-家族、caspase-3、-8、-10抑制剂可以部分地抑制NCTD诱导的细胞死亡。细胞凋亡时caspase-3、-8、-9酶活力升高,而且caspase-3的作用底物-caspase-3激活的DNA酶抑制物（ICAD）蛋白表达下降。结论：去甲斑蝥素通过激活caspase途径诱导HeLa细胞凋亡。     

Apoptosis in astrovirus-infected CaCo-2 cells

Cell death processes during human astrovirus replication in CaCo-2 cells and their underlying mechanisms were investigated. Morphological and biochemical alterations typical of apoptosis were analyzed in infected cells using a combination of techniques, including DAPI staining, the sub-G(0)/G(1) technique and the TUNEL assay. The onset of apoptosis was directly proportional to the virus multiplicity of infection. Transient expression experiments showed a direct link between astrovirus ORF1a encoded proteins and apoptosis induction. A computer analysis of the astrovirus genome revealed the presence of a death domain in the nonstructural protein p38 of unknown function, encoded in ORF1a. Apoptosis inhibition experiments suggested the involvement of caspase 8 in the apoptotic response, and led to a reduction in the infectivity of the virus progeny released to the supernatant. We conclude that apoptotic death of host cells seems necessary for efficient human astrovirus replication and particle maturation.     

Bcl-2硫代反义寡核苷酸对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究bcl-2硫代反义寡核苷酸(bcl-2ASODN)对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:采用MTT法、激光共聚焦显微镜、TUNEL法和AnnevinV/PI双染法检测bcl-2ASODN对A375细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR方法,观察bcl-2ASODN处理前后bcl-2mRNA在A375细胞表达水平的变化。结果:MTT法检测显示bcl-2ASODN抑制A375细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性;经30μmol/LASODN作用48h,激光共聚焦显微镜观察细胞呈现典型凋亡特征;TUNEL染色可见ASODN组多数A375细胞核被标记呈棕褐色,而SODN组和对照组细胞核未被明显标记;AnnexinV/PI检测ASODN组凋亡细胞比例升高,与SODN组和对照组均有显著性差异(P<0.001);RT-PCR结果显示bcl-2mRNA表达水平下降。结论:bcl-2ASODN可抑制A375细胞增殖和诱导A375细胞凋亡,其诱导凋亡的机制是下调bcl-2mRNA的表达。     

利拉鲁肽通过调节microRNA-375对胰岛细胞凋亡的影响

目的：观察利拉鲁肽通过微小RNA-375（microRNA-375,miR-375）对db/db小鼠胰岛细胞凋亡的影响,探讨其可能作用机制,为临床应用提供药效学依据。方法：20只8周龄雄性db/m小鼠为正常对照组,皮下注射等量的生理盐水。40只8周龄雄性db/db小鼠随机分为2组,每组20只：糖尿病对照组的db/db小鼠皮下注射等量生理盐水;利拉鲁肽组的db/db小鼠皮下注射利拉鲁肽300μg·kg-1·d-1。给药8周后,检测各组小鼠体重（BW）、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量,并进行腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT）和胰岛素耐量实验（ITT）;苏木精-伊红（HE）染色检测胰岛组织病理学变化;原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测胰岛凋亡情况;Westernblot法检测胰岛凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白水平;实时荧光定量PCR检测胰岛miR-375的表达水平。小鼠胰岛β细胞系MIN-6分为对照组（等量溶媒孵育）、miRNA-375mimic组和miRNA-375mimic+利拉鲁肽组,MTT实验检测细胞活力,Westernblot法检测各组细胞caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白水平。结果：整体实验中,与对照组相比,利拉鲁肽组BW、FBG、FINS、TC、TG及LDL-C含量明显降低（P<0.05）;胰岛数量较模型组增多,体积较大,细胞结构明显改善;胰岛细胞凋亡减少;利拉鲁肽组的Bcl-2表达明显增高,caspase-3和Bax的表达显著下降（P<0.05）;胰岛组织miR-375的水平显著降低（P<0.01）。细胞实验中,经miRNA-375mimic处理24h后,MIN-6细胞活力显著降低,Bcl-2表达减少,而caspase-3和Bax的蛋白水平显著增加（P<0.05）,给予利拉鲁肽组治疗后,MIN-6细胞活力明显上升,Bcl-2表达明显增高,caspase-3和Bax的蛋白水平显著下降（P<0.05）。结论：利拉鲁肽可以抑制糖尿病胰岛β细胞的凋亡,其机制可能与调控胰岛组织中miR-375的表达有关。     

蛴螬提取物对MCF-7人乳腺癌细胞株凋亡的影响

目的：研究蛴螬提取物对MCF-7人乳腺癌细胞株凋亡通路的影响,为天然药物蛴螬的开发提供实验和理论依据。方法:应用MTT法检测蛴螬提取物对MCF-7人乳腺癌细胞株的抗增殖作用及细胞毒活性;通过倒置显微镜、HE染色、吖碇橙（AO）/溴化乙啶（EB）荧光染色方法观察肿瘤细胞的形态学改变;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化;应用免疫细胞化学技术（S-P法）检测用药前后凋亡通路中Bcl-2、Fas、caspase-9、caspase-3的表达改变,探讨蛴螬提取物对凋亡通路的影响。结果:(1)用MTT法检测结果表明,蛴螬提取物在体外对MCF-7人乳腺癌细胞株有明显的抑制增殖作用,实验组与对照组相比其生长抑制率有显著差异（P<0.01）,而且这种抑制作用呈现浓度和时间的依赖性;(2)倒置显微镜观察表明,实验组可见胞核固缩、碎裂、凋亡小体形成等凋亡形态学变化;(3)HE染色表明实验组胞核浓缩呈蓝黑色、胞浆呈淡红色、核染色质浓缩、呈碎块状,有凋亡小体形成;(4)经AO／EB荧光染色观察结果表明,实验组出现凋亡细胞;(5)流式细胞仪结果表明实验组凋亡率明显增加,呈时间依赖性;(6)免疫细胞化学染色结果表明,实验组Bcl-2表达下调,Fas、caspase-3、caspase-9表达均上调,与对照组比差异显著（P<0.01）。结论:①蛴螬提取物在体外显著抑制MCF-7人乳腺癌细胞株增殖;②蛴螬提取物对MCF-7人乳腺癌细胞株凋亡通路的影响机制可能是通过下调Bcl-2,上调Fas、caspase-3、caspase-9的蛋白表达而起作用,是经由细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径来完成凋亡的启动和执行。     

Reconstitution of caspase-mediated cell-death signalling in Schizosaccharomyces pombe

Two pro-apoptotic proteases, caspase-1 and caspase-3, have been expressed as full-length proteins in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Both proteins autoprocess to generate the corresponding active enzyme and both are lethal to the yeast cell. Lethality is due to catalytic activity since the expression of the inactive mutant forms of both caspases does not result in an obvious phenotype. Caspase-expressing yeast can be rescued by co-expression of the baculovirus protein p35, a known inhibitor of the caspase family. Co-expression of Bcl-2, another anti-apoptotic protein, does not prevent the cell death induced by either caspase. However, Bcl-2 is itself cleaved by both caspase-1 and caspase-3 at two adjacent recognition sites, YEWD^31′A and DAGD^34′V respectively, immediately downstream from the N-terminal BH4 domain, a region of Bcl-2 which is essential for its anti-apoptotic activity; similar cleavage of Bcl-2 by caspases has been demonstrated in mammalian cells. Hence, key elements of the apoptotic pathway can be reliably reconstituted in fission yeast, opening the way to exploit yeast in order to study the control of apoptosis. Furthermore, the activity of caspase-3, although not caspase-1, can be demonstrated in vitro using chromogenic substrates. This offers the possibility of using caspase-producing strains of yeast to screen for chemical inhibitors either in vivo or in vitro. Received: 13 November 1998 / 15 April 1999