Wnt3a影响神经干细胞分化的体外研究

目的探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞（NSCs）体外分化的影响。方法采用机械分离、无血清传代培养法从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对其干细胞特性及其受体Fzd3蛋白表达进行鉴定,观察Wnt3a对NSCs体外分化的影响。结果海马NSCs表达特异性标志物巢蛋白及胞膜蛋白Fzd3;体外诱导分化,Wnt3a处理组神经元及星形胶质细胞分化的比例分别为11．25％±0．62％和56．26％±4．82％,而对照组则为8．54％±0．48％和168．42％±5．54％;组间分化差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论体外环境下Wnt3a能够促进NSCs向神经元分化,并抑制其向星形胶质细胞分化。     

Notch信号通路在神经干细胞分化与再生的研究进展

Notch信号通路是旁抑制效应调控神经干细胞分化及再生的重要信号通路之一,Notch信号通路维持神经干细胞静态,抑制神经干细胞的分化,对调节神经再生具有重要作用。     

脂肪干细胞诱导神经干细胞分化的体外实验研究

目的研究脂肪干细胞（ADSCs）体外诱导神经干细胞（NSCs）分化的作用。方法从新生BALB／c小鼠中分别分离获得ADSCs及NSCs,进行体外培养和传代。构建ADSCs与NSCs共培养体系,以单纯NSCs组为对照,进行ADSCs诱导分化研究。共培养4、8、12d后行神经元特异性神经丝200免疫组化鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率。结果共培养后8—12d,可见大量成熟神经元,大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突。共培养组NSCs分化为神经元的百分率大约为21％,而单纯NSCs培养组约为4％。共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异（P〈0．05）。结论ADSCs在体外能够促进NSCs向神经元转化。     

TrkA基因修饰、诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元

目的研究外源性TrkaA基因修饰C17．2神经干细胞，对神经干细胞定向分化的影响。方法采用脂质体法将携带有TrkA基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/TrkA转染C17．2神经干细胞，Western blot观察转染后基因表达情况；将正常生长的C17．2神经干细胞随机分成两组（A组和C组），将重组质粒转染阳性的C17．2神经干细胞随机分成两组（B组和D组），并用100ng／mg神经生长因子（NCF）分别作用于C组及D组，应用间接免疫荧光染色方法，观察各组细胞胆碱乙酰转移酶（CHAT）的表达。结果Western blot结果显示转染组TrkA蛋白表达明显高于非转染组，说明外源性TrkA基因导入靶细胞，并实现蛋白表达；间接免疫荧光染色显示，经NGF孵育的转染组细胞（D组）约有26％呈ChAT阳性，而非转染组（C组）约为9％，未经NGF孵育的A、B组未观察到CHAT阳性细胞。结论应用外源性TrkA基因修饰神经干细胞，造成TrkA基因过度表达，在NGF作用下，可以诱导更多的神经干细胞向胆碱能神经元分化。     

神经干细胞向多巴胺能神经元分化的条件

帕金森氏病 (ＰＤ)病理改变的最大特点是病变只侵犯单一类型的神经元[1] 。因此 ,ＰＤ就成为细胞替代治疗战略最有代表性的疾病。但无论是自体肾上腺髓质还是胚胎中脑以及经过基因修饰的胶质细胞、成纤维细胞、成肌细胞 ,在移植到宿主体内以后很快就失去了功能 ,说明这些细胞可能还不是理想的移植材料[2 ] 。存在于哺乳动物胚胎期及成年期的神经干细胞 (ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＮＳＣｓ) [3 ,4] 不但具有自我更新的能力 ,而且具有多向分化的潜能 ,在移植到宿主体内以后还可以与宿主的局部细胞相整合。这些优点都使ＮＳＣｓ成为细胞…     

神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的探讨神经干细胞的原代培养及γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的诱导分化.方法取孕16 dWistar大鼠的胚鼠全脑,进行体外培养,并对培养的神经干细胞以及诱导分化的GABA能神经元进行鉴定.结果培养24h后,出现2～4个细胞的细胞球.分化2d后,神经球贴壁后伸出细长突起,并可和周边神经球伸出的突起连接.神经球周边可见大量散在贴壁的双极或多极细胞.免疫荧光染色可见神经球均有nestin、NF200、GFAP阳性细胞.取第3代神经球行GABA能神经元定向分化.分化24h后,实验组细胞球贴壁.3d后,实验组细胞球周边有大量散在分布细胞贴壁生长,胞体圆形较大,有1～2个细长突起.免疫荧光显示,实验组周边散在的贴壁细胞多为GAD65阳性细胞.GAD65阳性细胞分化率实验组(85.97±2.78)%、对照组(18.16±2.29)%,P<0.01.结论本实验利用寡核苷酸序列特异性阻断了bHLH基因家族的调控因子之一Hes1,解除了其对bHLH的抑制,促进了神经干细胞向神经元的分化.实验还发现,阻断Hes1后大大提高了神经干细胞向GABA神经元分化的比率.     

去分化肌肉干细胞神经增殖与分化能力的研究

目的研究和鉴定去分化肌肉干细胞是否具有神经增殖和分化能力。方法使用不同的条件性培养基,对去分化肌肉干细胞依次进行神经增殖和神经分化诱导,并通过形态学、免疫细胞荧光化学、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等手段加以鉴定。结果①去分化肌肉干细胞在神经增殖培养基诱导下,形成典型神经球(neurospheres)结构,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)标记阳性,抗巢蛋白(Nestin)阳性;RT-PCR提示肌形成蛋白(myogenin)表达水平下调,而Nestin、干细胞抗原-1(Sca-1)表达上调。②经神经分化培养基诱导,神经球细胞可分化为形态学上典型的、抗中间神经丝蛋白(NFm)阳性神经元。结论去分化肌肉干细胞具有神经增殖和分化潜能。     

维甲酸对神经干细胞的增殖和分化效应

目的 探讨不同浓度维甲酸对神经干细胞的增殖和分化的效应。方法 分离、培养胎龄14d的Wistar孕鼠的神经干细胞，通过与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF对比观察维甲酸的促增殖效应；运用神经微丝200（NF-200）和神经胶质酸性纤维蛋白（GFAP）对维甲酸诱导分化的细胞进行组化染色，通过4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染胞核，计数各种分化细胞的比例，并对分化的神经元进行胆碱能表型鉴定。结果 维甲酸的增殖效应明显弱于bFGF，但其具有明显的促神经元生成的分化效应，并表达递质，在分化第24天，500nmol／L的浓度使分化的神经元占分化的总细胞数的90．80％。结论 维甲酸具有显著的促神经干细胞分化成神经元的效应。     

微环境信号与神经干细胞的定向诱导分化

重点阐述了胚胎神经干细胞在体内微环境及体外诱导条件下能够定向分化为多巴胺能神经元的可行性及神经干细胞移植治疗帕金森病亟待解决的问题。     

兔间充质干细胞诱导纹状体神经干细胞分化为神经细胞的研究

目的研究兔纹状体间充质干细胞诱导神经干细胞分化为神经细胞的可行性和机制。方法培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)融合达90%时,更换培养基无血清培养24h,收集细胞培养液即为其条件培养基。取成年兔纹状体细胞进行神经干细胞培养,加BMSC条件培养基进行神经干细胞的诱导分化。结果2～4h后神经干细胞开始贴壁,随后有突起从干细胞长出,7d后出现大量不同形态的分裂增殖新生神经细胞,较对照组神经元数量增加,有显著性差异,细胞折光性强,突起长,生存时间延长。结论间充质干细胞能提高神经干细胞诱导分化为神经元的数量,并能延长神经元的生存时间。     

Wnt signal pathways and neural stem cell differentiation

Self-renewal, migration and differentiation of neural progenitor cells are controlled by a variety of pleiotropic signal molecules. Members of the morphogen family of Wnt molecules play a crucial role for developmental and repair mechanisms in the embryonic and adult nervous system. A strategy of disclosure of the role of different canonical (glycogen synthase kinase-3beta/beta-catenin-dependent) and noncanonical (Ca2+- and JNK-dependent) signal pathways for progenitor cell expansion and differentiations is illustrated at the example of the rat striatal progenitor cell line ST14A that is immortalized by stable retroviral transfection with a temperature-sensitive mutant of the SV40 large T antigen. A shift from permissive 33 degrees C to nonpermissive 39 degrees C leads to proliferation stop and start of differentiation into glial and neuronal cells. Investigation of expression of Wnts, Wnt receptors and Wnt-dependent signal pathway assay point to a stage-dependent involvement of canonical and noncanonical signaling in proliferation and differentiation of ST14A cells, whereby a mutual suppression of pathway activities is likely. Canonical Wnt molecules are not detected in proliferating and differentiating ST14A cells except Wnt2. The noncanonical Wnt molecules Wnt4, Wnt5a and Wnt11 are expressed in proliferating cells and increase during differentiation, whereas cellular beta-catenin decreases in the early phase and is restored in the late phase of differentiation. Accumulation of beta-catenin at the membrane in undifferentiated proliferating cells and its nuclear localization in nondividing undifferentiated cells under differentiation conditions argues for a distinct spatially regulated role of the molecule in the proliferation and early differentiation phase. Ca2+-dependent and JNK-dependent noncanonical Wnt signaling is not detected during differentiation of ST14A cells. Complete exploration of the role of Wnt pathways, for differentiation of the neural progenitor cells ST14A will require Wnt overexpression and exposure of ST14A cells to exogenous Wnts either with purified Wnts or by co-cultures with Wnt producers.     

Wnt信号通路与骨髓间充质干细胞增殖及分化的关系

骨髓间充质干细胞（bonemarrow—derived mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨髓中不同于造血干细胞的一类细胞,其来源丰富,取材简便,易分离、纯化、培养,在一定的条件下可以迅速体外扩增,具有多向分化潜能,可以通过不同的方法被诱导分化成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经胶质细胞、神经元细胞等,而且它具有低免疫源性,向病变部位迁移的能力,     

Wnt信号分子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

间充质干细胞可向神经方向转化,但分子机制目前不清楚。 目的：观察Wnt3a和Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中的作用。 方法：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代后通过形态学和流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14,CD44,CD9,CD34,CD45表达。采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a的诱导方案,免疫组织化学法和RT-PCR检测Wnt3a、Wnt5a在骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中的作用。 结果与结论：骨髓间充质干细胞为长梭形,表面标志物CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达。诱导后细胞Wnt3a诱导组巢蛋白,神经元特异性烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,细胞活力良好。Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显。胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带。提示Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

Dynamic changes in Wnt signaling are required for neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells

Embryonic stem cells (ESC) and the epiblast share a similar gene expression profile and an attenuated cell cycle, making them an accessible and tractable model system to study lineage choice at gastrulation. Differentiation of the epiblast and ESC to the mesendodermal lineage has been shown to rely on Wnt/β-catenin signaling; which counterintuitively, is also required to inhibit differentiation and maintain pluripotency. To examine these seemingly contradictory roles, we developed a mouse ESC (ESC) line that inducibly expresses a dominant negative Tcf4 (dnTcf4) protein to block canonical Wnt signaling. Cells expressing the dnTcf4 protein differentiated largely to Sox3 positive neural precursors but were unable to progress to βIII tubulin positive neurons unless Wnt signaling was derepressed, demonstrating a sequential requirement for Wnt signaling in lineage differentiation. To determine if Wnt/β-catenin signaling is similarily required at sequential stages of neural differentiation in the intact embryo, we delivered shRNA targeting β-catenin to pregnant mice on E5.5 of development. Blocking canonical Wnt signaling during post-implantation development increased the number of neural precursors which failed to differentiate to mature neurons, and produced defects of embryonic axis elongation, neurulation and neural tube closure that phenocopy the β-catenin null embryo. These results demonstrate that lineage differentiation relies on sequential repression and derepression of critical signaling pathways involved in maintaining pluripotency versus differentiation.     

食蟹猴神经干细胞的培养与分化

背景：关于神经干细胞以往研究多集中在啮齿类和人类,涉及非人灵长类的神经干细胞研究较少。 目的：建立食蟹猴神经干细胞的体外分离培养方法,并观察其分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-07/2009-04在中山大学干细胞与组织工程研究中心完成。 材料：孕3~5个月的食蟹猴流产胚胎,由蓝岛生物技术有限公司(华南非人灵长类研究开发中心)提供。 方法：取食蟹猴胚胎的室管膜下区及海马区脑组织,放入神经干细胞悬浮培养液中,巴氏吸管吹打分散,得到单细胞悬液,调整细胞浓度为(2.0~5.0)×105接种于25 cm2培养瓶中,在37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下进行原代悬浮培养。待形成神经球2周后,接种于预先包被多聚鸟氨酸/纤维连接蛋白的培养板上进行贴壁培养。每天向孔内添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子各20 μg/L,待细胞增殖到90%左右传代扩增。 主要观察指标：利用免疫细胞荧光化学技术,对体外培养的食蟹猴神经干细胞表面标志性抗原nestin及其分化潜能进行鉴定。 结果：悬浮培养1周后,倒置显微镜下可见神经球形成,神经球在培养过程中逐渐增大。第4周将神经球进行贴壁培养后,24 h可见神经球贴附于板壁,并有突触从球中伸出,随后大量细胞从神经球中迁出,逐渐铺满板壁。添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子培养的神经干细胞呈nestin+,而未添加两种因子的神经干细胞呈GFAP+,Tuj 1+,O4+。 结论：悬浮培养与贴壁培养相结合的方法较适合食蟹猴神经干细胞的培养及传代,分离出的食蟹猴神经干细胞具有分化为 星形胶质细胞、神经元细胞、少突胶质细胞的能力。     

HB-GAM inhibits proliferation and enhances differentiation of neural stem cells

Proliferation of neural stem cells in the embryonic cerebral cortex is regulated by many growth factors and their receptors. Among the key molecules stimulating stem cell proliferation are FGF-2 and the FGF receptor-1. This ligand-receptor system is highly dependent on the surrounding heparan sulfates. We have found that heparin-binding growth-associated molecule (HB-GAM, also designated as pleiotrophin) regulates neural stem cell proliferation in vivo and in vitro. Deficiency of HB-GAM results in a pronounced, up to 50% increase in neuronal density in the adult mouse cerebral cortex. This phenotype arises during cortical neurogenesis, when HB-GAM knockout embryos display an enhanced proliferation rate as compared to wild-type embryos. Further, our in vitro studies show that exogenously added HB-GAM inhibits formation and growth of FGF-2, but not EGF, stimulated neurospheres, restricts the number of nestin-positive neural stem cells, and inhibits FGF receptor phosphorylation. We propose that HB-GAM functions as an endogenous inhibitor of FGF-2 in stem cell proliferation in the developing cortex.