LIGHT基因的克隆及其可溶性表达

目的　克隆LIGHT基因 ,构建含有人LIGHT基因的表达载体 ,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达 ,并对表达的LIGHT蛋白的生物学活性进行检测。方法　从人的外周血单个核细胞中克隆LIGHT全长cDNA及其胞外区片段 ,并将其胞外区片段亚克隆至原核表达载体pET 11a中 ,筛选阳性重组质粒pET LIGHT ,以IPTG诱导其可溶性表达 ,并以SDS PAGE和Westernblot检测进行分析。表达的蛋白初步纯化后 ,进行生物学活性分析。结果　RT PCR扩增出了LIGHT全长 72 3bp的cDNA。SDS PAGE和Westernblot分析证实重组pET LIGHT质粒可表达出相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白。可溶性LIGHT重组蛋白可共刺激T细胞的增殖及诱导IFN γ的产生。结论　本实验成功地将LIGHT胞外区片段在大肠杆菌中进行表达 ,表达的蛋白具有生物学功能 ,这为进一步的LIGHT基因的功能研究打下了基础     

人THANK cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达

目的克隆THANKcDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法采用RT-PCR技术,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因,PCR产物直接克隆于pMD-18T载体中,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞外区基因亚克隆到原核表达载体pET-11a中。阳性重组子,以1mmol/LIPTG进行诱导表达,以SDS-PAGE分析THANK胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理后,进行生物学活性检测。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示,该片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体,转化大肠杆菌表达后发现,与阴性对照相比,在相对分子质量（Mr）26×104处多显示出一条条带。对该蛋白进行初步活性测定显示其可显著地抑制U937细胞的生长。结论本实验成功地克隆了人THANK基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌中进行了表达,表达的重组蛋白可抑制U937细胞的生长。这为进一步进行THANK基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出760bp的片段,反向插入到pGEM-3Zf( )载体上,获得pGEMBF18克隆,限制性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长编码片段,与原核表达载体pGEX-5T连接,构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的7.53%,Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。     

鸡MxA基因的克隆、表达及生物学活性检测

目的：克隆鸡MxA基因，构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从鸡成纤维细胞（CEF）中扩增MxA，将其克隆至克隆载体pMD18-T中，筛选阳性克隆后回收目的片段，将其克隆人原核表达质粒pGEX-6p—1，构建其重组表达质粒pGEX—MxA，以IPTG诱导表达，经SDS—PAGE、鸡胚新城疫病毒干扰试验和VSV-CEF微量细胞抑制试验进行分析、鉴定。结果：经RT—PCR扩增获得的MxA序列与GeneBank报道的序列一致，SDS—PAGE和干扰试验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45000的蛋白，与GST—MxA融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了鸡MxA基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌DIL5ct中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST—MxA，为进一步探讨MxA的生物学活性，探索抗病毒药物的研发奠定了基础。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

杀菌/通透性增加蛋白N端片段在原核细胞中的表达及其临床应用的初步探讨

目的：构建编码杀菌，通透性增加蛋白(BPI)N端片段基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法：采用RT-PCR技术，从人外周血中性粒细胞的总RNA中扩增BPI蛋白N端片段cDNA编码区基因，DNA序列分析鉴定；将测序证实的BPI蛋白N端片段编码区基因PCR产物直接克隆于原核表达载体pBAD／Thio-TOPO中，再次测序鉴定；通过在大肠杆菌中以L-阿拉伯糖进行诱导表达，然后以SDS-PAGE、Westerm blot对表达的重组蛋白进行分析。重组蛋白经初步纯化处理后，进行生物学活性检测。结果：RT-PCR扩增出一个835bp的DNA片段，DNA测序表明为所需目的基因。限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，BPI蛋白N端片段正确克隆到大肠杆菌表达载体pBAD／Thio-TDPO中，SDS-PAGE和Wester blot结果表明在大肠杆菌中成功表达了BPI蛋白N端片段。对该蛋白进行初步活性测定显示其可与BPI单克隆抗体结合并具有杀灭耐药铜绿假单胞菌的活性。结论：成功构建了BPI蛋白N端片段编码区基因原核表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达，表达的重组蛋白具有一定的生物活性。     

TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定

目的：构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法：利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段，约1800bp，然后将其克隆入pMD18-T载体中。测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果：PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒经酶切鉴定及测序证实，TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HBl01后用IPTG诱导，获得Mr92 000的GST-TLR4融合蛋白；37℃，O.2mmol／L IPTG诱导4h，SDS-PAGE电泳后，经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34．25％，部分以包涵体存在，可溶性蛋白约占27．84％；亲和层析纯化后纯度大于90％。Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合。结论：成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得了纯度大于90％的可溶性GSI-TLR4融合蛋白，为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

核心链霉亲和素基因的克隆及表达

文章采用PCR方法 ,以链霉亲和素菌 (Streptmycesavidinii)基因组DNA为模板 ,克隆出 384bp的DNA片段并以BamHI及XhoI位点装入PSK载体 ,经测序确证为核心链霉亲和素基因 (core strepavidin )。将该基因重组到质粒pET 2 4a ( + ) ,构建重组表达质粒pET 2 4a CS。转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导后得到高效表达。SDS PAGE图谱显示表达产物相对分子质量为15 0 0 0 ,与其基因编码蛋白的理论值相符。HRP标记的生物素作为抗体进行Westernblot,结果在 15 0 0 0处可见特异性条带 ,因此表明核心链霉亲和素能与生物素特异性结合     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.     

HER-2/neu胞外配体结合区基因的克隆及原核表达

目的 克隆HER—2／neu配体结合区基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。方法 用PCR技术扩增HER—2／neu脑外配体结合区的cDNA片段，并将该片段插入pET-28a(t)原核表达载体中，实现插入基因的融合表达；用SDS—PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果 构建的重组质粒在大肠杆菌中获得高效稳定的表达，表达产物的相对分子质量与预期值一致，且所表达蛋白可被抗HER—2/neu的特异性抗体识别。结论 获得了HER—2／neu脑外配体结合区基因在原核系统中的表达，为HER—2／neu高表达肿瘤的疫苗研究奠定了基础。     

DR5胞外段基因的表达及功能初步鉴定

目的：获得具有生物活性的人DR5胞外段蛋白。方法：通过RT-PCR从Jurkat细胞中钓取DR5的胞外段基因（55—183位氨基酸），克隆到pGEM-T Easy载体中，经核酸序列测定正确后，将其再次克隆入原核表达载体pET30a中，在Ecoli B121（DE3）实现蛋白表达。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定表达产物。ELISA法分析其与抗DR5单克隆抗体（mAb）结合能力。结果：克隆到人DR5基因的胞外段基因，测序结果和报道的一致；构建了人DR5胞外段基因的原核表达载体并实现在E．coli B121（DE3）中大量表达；SDS—PAGE表明所表达蛋白与预期蛋白的相对分子质量（Mr）一致；Western blot及ELISA的结果表明该蛋白能与抗DR5抗体反应，竞争阻断试验表明DR5胞外段可阻断TRAIL对Jurkat细胞生长的抑制。结论：成功地制备了具有生物活性的DR5胞外区，为后续研究打下了基础。     

宫颈癌相关新癌基因hWAPL的原核表达和免疫原性分析

目的:构建hWAPL原核表达载体,诱导hWAPL蛋白表达并制备其多克隆抗体。方法:RT-PCR技术扩增hWAPL cDNA片段,连接到pMD18-T载体,测序正确后亚克隆入原核表达载体pET28a并转化BL21菌株,用SDS-PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,制备hWAPL蛋白并免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定其抗体效价,Western blot鉴定表达hWAPL蛋白的免疫原性。结果:①经PCR、双酶切鉴定和测序,证实hWAPL正确插入pMD18-T载体,序列正确。②经IPTG诱导的pET28a-hWAPL重组菌表达出相对分子质量(Mr)约为25000的蛋白,与预期蛋白Mr相符。③免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1∶3200。④Western blot结果显示Mr约25000处有反应蛋白条带。结论:pET28a载体能够表达hWAPL蛋白,表达蛋白具有良好的免疫原性,其免疫小鼠后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性。     

人热休克蛋白70基因的原核表达

目的 表达人热休克蛋白70（HSP70）并进行鉴定。方法 用PCR方法扩增人HSP70基因片段，经T-A克隆法克隆到载体pUCm-T中，并进行DNA测序，将人HSP70基因片段从载体pUCm-T中酶切后，构建重组表达载体pGEX-4T-1-HSP70，并转化大肠杆菌JM109，用IPTG诱导，收集细菌，菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 人HSP70基因的PCR产物约为1.9kb。序列测定结果证实，所获目的序列与文献[3]报道的相一致，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定证实。人HSP70基因已成功地克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建的表达载体pGEX-4T-1-HSP70，能很好地在大肠杆菌中表达相对分子质量（Mr)为96000并具有抗原特性的融合蛋白，结论 成功地克隆并表达了HSP70基因，为研究HSP70的结构。功能与临床应用提供了必要条件。     

人可溶性TRAIL基因的克隆及表达

为了利用大肠杆菌表达人可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体 (TRAIL )蛋白 ,应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增人可溶性TRAIL蛋白cDNA ,克隆入PCR2 1 载体 ,测序验证后用基因重组法分别构建了人可溶性TRAIL蛋白的真核与原核表达质粒载体。将重组质粒分别转入COS 7和大肠杆菌M1 5中表达。用流式细胞仪检测人可溶性TRAIL蛋白在COS 7细胞中的瞬时表达 ,用SDS PAGE电泳和Westernblot鉴定大肠杆菌中的表达产物。所表达融合蛋白为人可溶性TRAIL蛋白分子 ,相对分子质量为 2 1 0 0 0 ,表达量约为 2mg/ml。所表达的人可溶性TRAIL蛋白具有诱导HL 60细胞凋亡的作用。上述结果提示大肠杆菌可良好表达具有生物活性的人可溶性TRAIL蛋白 ,为深入研究TRAIL分子在肿瘤与自身免疫性疾病中的可能应用提供了材料。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

THANK基因的克隆和序列分析

目的 克隆ＴＨＡＮＫ基因全长及胞外区片段并测序。方法 采用ＰＴ－ＰＣＲ技术,唑人白血病细胞系ＨＬ－６０细胞总ＰＡＮ中扩增人ＴＨＡＮＫ ｃＤＮＡ,并定向克隆于ｐＭＤ－１８Ｔ载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ＾ＴＭ３７７ＸＬＤＮＡ 自动测义测序。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个８５８ｂｐ的ＤＮＡ片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该８５８ｂｐ片段为编码入ＴＨＡＮＫ的ｃＤＮＡ,与公布