MLVA用于新疆部分地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究

目的探讨结核菌株进行多位点可变数目串联重复序列分析(the multiple locus VNTR analysis,MLVA)。方法选择2010年至2011年新疆维吾尔自治区第五次结核病流行病学抽样调查资料,采用经典24位点方法进行基因分型。并采用Bio Numerics5.0数据库进行基因聚类分析。将结核分枝杆菌原始株,取一菌环溶于400μl TE中悬菌,80℃1 h灭活,12 000 r/min离心10 min,弃上清,600μl TE重新悬菌,进行多位点串联重复序列分析。结果新疆99株结核分枝杆菌分为2个基因群:分别为基因群Ⅰ和基因群Ⅱ,基因群Ⅰ66株(66.7%),基因株Ⅱ33株(33.3%);基因群Ⅰ是北京家族,基因群Ⅰ的66株结核分枝杆菌有65种不同的基因型,有2株结核分枝杆菌属于同一簇,成簇率为1.5%,基因群II33株结核分枝杆菌菌株的MLVA图谱不同,成簇率为0。结论新疆结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,以北京基因型菌株为主,同时还存在一定比例的非北京基因型,应加强对主要流行菌株流行的监控及管理。     

Spoligotyping和MLVA用于71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株基因分型的初步研究

目的初步探讨寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)用于浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株的分型,以初步了解浙江省结核分枝杆菌的基因型特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA。采用聚合酶链反应(PCR)扩增整个DR区进行Spoligotyping分型,同时分别扩增15个VNTR位点进行MLVA分型。聚类分析采用BioNumerics软件。统计学分析采用卡方检验。结果对70株菌进行了基因分型,Spoligotyping结果显示,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占70和30,49株北京家族菌株中,89.8为典型北京家族;MLVA结果显示,可分4个基因群,分别为Ⅰ群占8.5,含5个基因型,Ⅱ群占18.3,含13个基因型,Ⅲ群占70.4,含38个基因型,Ⅳ群占2.8,含2个基因型。两种方法对菌株的基因分型结果非常吻合,Spoligotyping分型为北京家族的菌株均分布在MLVAⅢ型中,非北京家族菌株的基因多态性,分属于MLVAⅠ、Ⅱ和Ⅳ型。MLVA将70株菌分为58个基因型(含53个独特基因型),而Spoligotyping只分为18种基因型(含12个独特基因型)。结合对临床一线4种药物的耐药检测结果分析,两种方法的分型结果均显示北京家族菌株中表现为全敏感者71.4(35/49),表现为耐药者为28.6(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7,表现为耐药者为33.3,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义(χ2=0.158,P>0.05)。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为北京家族。北京家族与耐药无明显相关性。MLVA株水平鉴定能力明显高于Spoligotyping,尤其是在鉴别北京家族菌株上具有明显的优势。     

甘肃省临床分离结核分枝杆菌MLVA分型初步研究

目的随机选取2005-2007年间甘肃省肺科医院临床分离结核分枝杆菌菌株,通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandemrepeats analysis,MLVA)分型,了解甘肃结核分枝杆菌流行菌株基因型情况。方法选择标化的15个VNTR位点,对临床分离菌株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用Bio Numerics4.5软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果 228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个大基因类型,分别包含13(5.7%)、3(1.3%)、7(3.1%)、1(0.4%)、171(75%)、31(13.6%)、2(0.9%)个株菌;在株水平基因分型上,93(40.8%)株为单菌株基因型;其余菌株基因型分别包含2-10株结核分枝杆菌,共构成132个基因簇。结论甘肃结核分枝杆菌菌株存在丰富的基因多态性,ML-VA方法具有较高的基因分型能力,可以满足结核分枝杆菌株水平DNA分型的需要。甘肃省结核分枝杆菌流行株主要为北京家族基因型菌株。     

不同VNTR位点组合用于北京基因型结核分枝杆菌基因分型的研究

目的评价不同串联重复序列（VNTR）位点组合在北京地区北京基因型结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法采用多位点数目可变串联重复序列分析（MLVA）技术对72株北京地区北京基因型菌株的24个VNTR位点进行分析，基因多态性分析采用BioNumerics软件。结果24个位点的多态性差异较大，位点QUB-11b（HGI 0．651）、Mtub 21（HGI 0．556）和QUB-26（HGI 0．518）的多态性较高，有两个位点（MIRU2和MIRU24）则不具有多态性；不同VNTR位点组合（12位点，15位点，24位点）在北京基因型菌株中的分辨指数依次升高，分别为0．788，0．990．0．992，后两个组合的差异仅是由位点Mtub 29引起的。结论不同的VNTR位点在北京地区北京基因型菌株中的分辨力存在差异；推荐的基础VNTR15位点与Mtub 29组合可作为北京地区结核分枝杆菌分子流行病学研究的一线方法。     

江苏省67株结核分支杆菌MLVA分型分析

目的初步探讨江苏省结核分支杆菌的数目可变串联重复序列(VNTR)的分布特征。方法采用多位点串联重复序列(MLVA)分型方法,对从江苏省病人分离的结核分支杆菌的VNTR进行PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳,通过BioNumerics3.0软件分析其VNTR的多态性和聚类分析。结果共选取了15个VNTR位点,对67株结核分支杆菌进行了检测分析,结果显示明显的基因多态性,可分8个基因型(Ⅰ～Ⅶ型),其中较多的一型菌株占32.6%,其他型别菌株数量较接近,没有特别明显的优势型别。结论江苏省结核分支杆菌具有明显的多态性,MLVA分型技术具有稳定、简单、可重复的优点,可用于结核分支杆菌的流行病学调查。     

大理地区结核分枝杆菌MIRU-VNTR位点的多态性分析

目的了解大理地区结核分枝杆菌基因组中的数目可变串联重复序列（variable number tandem repeat,VNTR）即MIRU（mycobacterium interspersed repetitive unit）基因多态性,探讨MIRU-VNTR位点多态性的应用价值。方法采用PCR和琼脂糖凝胶电泳检测大理地区临床分离的60株结核分枝杆菌7个VNTR位点,采用MIRU-VNTR技术进行分型,利用Hunter-Gaston指数（HGI）对各MIRU进行分辨力评价,并应用Quantity one软件和BioNumerics6.6软件进行数字化和聚类分析。结果 60株结核分枝杆菌分为5个基因群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ群）52个基因型。Ⅰ群占56.77%,含有29个基因型;Ⅱ群占25.00%,含有13个基因型;Ⅲ群占8.33%,含有5个基因型;Ⅳ群占6.67%,含有3个基因型;Ⅴ群占3.33%,含有2个基因型。7位点组合总分辨力为0.900,最高ETR-E位点0.735,最低ETR-C位点0.455。结论大理地区分离株结核分枝杆菌存在基因多态性,7位点MIRU-VNTR分型简便快速,分辨力高,适合用于大理地区结核分枝杆菌的基因分型检测。     

天津地区临床分离株结核分枝杆菌分子流行病学研究

目的探讨天津地区结核分枝杆菌临床分离株分子流行病学特征。方法连续收集天津市海河医院2005年8月16日～11月25日就诊病人痰培养阳性的结核分枝杆菌100株，采用间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）和数目可变串联重复序列（VNTR）两种方法进行基因分型，并运用软件对二者的结果进行分析。依据北京分化支的定义。运用多重和实时定量PCR方法将其区分为W菌/典型北京家族菌株和非典型北京菌株，x^2检验分析两种亚群与患者年龄和耐药性之间的联系。结果排除污染菌株，共对96株结核分枝杆菌临床分离株进行两种方法的基因分型，Spoligotyping结果为91．7％为北京基因型（含3株类北京基因型）结核分枝杆菌（88／96）。VNTR分型可将北京基因型分为60种基因型。在北京分化支结核分枝杆菌中，W菌/典型北京家族菌株占93．2％（82／88）。两种北京分化支亚群与患者年龄和耐药性没有显著性统计学差异（P〉0.05）。结论天津地区结核病患者临床分离的结核分枝杆菌中，北京基因型呈现较为明显的优势。VNTR的分辨率明显高于Spoligotyping。北京分化支的两种亚群在天津地区临床结核病患者中均存在流行，但以W菌/典型北京家族菌株为主。     

多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选

目的对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列（variable number tandem repeats,VNTR）分析（multiple loci VNTR analysis,MLVA）中不同位点组合在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）基因分型研究中的应用。并以IS6110限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）为参照,筛选有效位点。方法分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果。结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU）-12系列的HGI（Hunter-Gaston Index）值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型。VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型。结论北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行。对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法 ,其分辨率能够达到MTB基因分型＂金标准＂IS6110-RFLP水平。     

安徽省391株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的 初步探讨安徽省结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的分型及分布特征。方法 选取安徽省结核分枝杆菌391株临床分离菌株,常规培养、收集菌体,提取基因组DNA,采用聚合酶反应（PCR）对15个VNTR位点进行检测分析,基因分型聚类分析采用BioNumerics 5.0软件。结果 经基因聚类分析,可分4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群和Ⅳ群),分别为Ⅰ群占3.32%（13/391）,Ⅱ群占3.07%（12/391）,Ⅲ群所占89.00%（348/391）,Ⅳ群占4.60%（18/391）;共含183个基因型,其中149株为独特类型,余242株分为34簇,其中最大的一簇包含64株（基因型为424343357333544）;研究显示明显的基因多态性,Mtub21和MIRU26位点显示较高多态性（h）,分别为0.591和0.527;ETR-B、ETR-C、ETR-D和MIRU23显示较低多态性,h分别为0.125、0.08、0.124和0.137;基因群分布与药敏间的差异无统计学意义(χ²值分别为0.22、0.00、0.01、0.07,P值均>0.05)。结论 初步证实安徽省结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,以Ⅲ型菌株为主,应加强对此型菌株流行的监控。     

RD105缺失基因检测法及VNTR技术用于河南省结核分支杆菌基因分型分析及其耐药相关性研究

目的了解河南省结核分支杆菌＂北京家族＂基因型的分布、多位点可变串联重复序列（VNTR）基因型特征及其与耐药的相关性。方法应用VNTR技术、RD105缺失检测法分析结核分支杆菌的基因型,聚类分析采用B ionumberics5.0软件分析。结果 154株结核分支杆菌临床分离株中,人型结核分支杆菌137株,非结核分支杆菌14株,结核分支杆菌复合群3株;RD105缺失基因检测法检测结核分支杆菌菌株137株,＂北京家族＂基因121株（88.3%）;7位点VNTR检测结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析,可分为3个基因群（Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群）,其中Ⅰ群为主要流行群,占90.5%（124/137）,含114个基因型。耐多药率为6.6%（9/137）。结论河南省结核分支杆菌以＂北京家族＂基因型为主要流行株,应引起重视;＂北京家族＂基因型与耐药无明显相关性。     

贵州某结核病高发县结核分枝杆菌流行情况的初步研究

目的分析结核病高发县结核分枝杆菌临床分离株及其基因型特征,探索高疫情地区结核菌株流行情况。方法在罗甸县结核病定点医院门诊收集临床分离的分枝杆菌菌株,用PNB生长试验、结核分枝杆菌散在重复单位(VNTR) 和RD105缺失基因检测法分别进行菌种、结核分枝杆菌DNA多态性和北京基因型鉴定。结果80株菌株中非结核分枝杆菌占12.5%,70株结核分枝杆菌中北京家族占42.9%,非北京家族占57.1%。VNTR结果显示,菌株可分为5个基因群,其中 I群占15.7%,含 11个基因型,Ⅱ群占35.7%,含25个基因型,Ⅲ群占15.7%,含11个基因型,Ⅳ群占30.0%,含 21个基因型,Ⅴ群占2.9%,含2个基因型,未见成簇菌株。结论初步证实罗甸县结核分枝杆菌存在基因多态性,Ⅱ群、Ⅳ群为当地主要流行群,同时存在一定比例的非结核分枝杆菌感染。     

重庆市结核分枝杆菌临床分离株的基因分型及相关耐药性分析

目的 对重庆市结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,研究不同基因型在重庆的流行情况,并分析基因型与耐药表型的关系。 方法 收集2011年1-12月重庆市结核病防治所分离的113株结核分枝杆菌临床分离株,采用比例法进行药物敏感性检测;应用间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）和PCR方法对113株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型。 结果 在113株结核分枝杆菌临床分离株中,可分为北京家族和非北京家族,分别占77株（68.1%,77/113）和36株（31.9%,36/113）;北京家族菌株中现代型为48株（62.3%,48/77）,古代型为29株（37.7%,29/77）;非北京家族菌株中,T1型高达13株（36.1%,13/36）,发现9种新基因型。北京家族菌株耐药率为24.7%（19/77）,非北京家族菌株耐药率为38.9%（14/36）,差异无统计学意义（χ²=2.40,P>0.05）。现代型北京家族菌株耐药率为27.1%（13/48）,古代型北京家族菌株耐药率为20.7%（6/29）,差异无统计学意义（χ²=0.39,P>0.05）。 结论 重庆地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行基因型为北京家族,其中北京家族中主要为现代型;北京家族菌株、非北京家族菌株均与耐药性无明显相关性。     

114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型研究

目的 了解HIV/MTB双重感染病例中结核分枝杆菌基因型构成情况以及北京家族基因型菌株所占的比例,为HIV/MTB双重感染病例结核病预防控制提供分子流行病学依据。方法 收集HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌临床分离株114株,利用间隔寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术对所收集的临床分离株进行分型研究,分析HIV/MTB双重感染病例中结核分枝杆菌基因型构成情况及主要流行型。结果 114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌成2个大的基因家族,即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family),分别占66.7%(76/114)和33.3%(38/114),共30种基因型。其中,非北京家族包括T家族共18株,H家族共5株,EAI5基因家族1株,CAS1_DEHLI基因家族1株及12种在数据库中没有对应基因家族或没有匹配的结果的新基因型13株。结论 HIV/MTB双重感染病例中,结核分枝杆菌基因型呈明显的多态性,北京家族基因型菌株仍为HIV/MTB双重感染病例中结核分枝杆菌主要流行菌株。     

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。     

结核性脑膜炎临床分离株的耐药性和基因型相关性分析

目的 了解结核性脑膜炎（tuberculous meningitis,TBM）的致病菌在耐药性和基因型方面的相关性.方法 从500例疑似TBM患者脑脊液标本中经MGIT（Mycobacteria growth indicator tube）960培养仪分离培养出25株结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）,对这25株Mtb分别进行间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）法基因分型、14种抗结核药物的药物敏感性试验、10个耐药基因测序.结果 20株为北京基因型,占80.0％（20/25）;耐多药结核性脑膜炎（MDR TBM）有3株（3/25）,都属于北京基因型;测序结果显示inhA、embB、gyrB、eis 基因未发生突变,katG、rpoB、gyrA、rrs-KAN、rpsL、gidB基因发生突变.结论 北京基因型在耐药TBM中所占比例高,尤其是MDR-TBM.耐药TBM临床分离株与相关耐药基因突变有关系.     

大理地区合并HIV双重感染者结核分枝杆菌MLVA法基因分型研究

目的 探讨MLVA基因分型法在云南大理地区合并HIV双重感染者结核分枝杆菌基因分型中的运用,初步研究其基因型特征。方法 选取大理地区61株合并HIV双重感染者结核分枝杆菌临床分离株,采用聚合酶链反应(PCR)分别对VNTR位点进行检测分析,应用BioNumerics(6.6)软件进行聚类分析。结果 共对61株合并HIV双重感染者的结核分枝杆菌的15个VNTR位点进行检测,呈现出明显的基因多态性。各个位点的分辨能力不同,其中MIRU26(0.839)最高,MIRU4(0.341)最低。经聚类分析,61株双重感染结核分枝杆菌菌株可分为5个基因群,61个基因型,以Ⅰ型占比例最大占51.6%(32/61);H37Rv减毒株在Ⅱ型。结论 大理地区合并HIV双重感染者结核分枝杆菌VNTR基因存在明显多态性,主要流行菌群为北京家族基因型。     

结核性脑膜炎临床分离株基因型和耐药表型的特征分析

目的 了解导致结核性脑膜炎(TBM)的致病菌在基因型和耐药表型方面的特征。 方法 利用间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)和数目可变串联重复序列 (VNTR)分型法对25株TBM临床分离菌株进行基因分型;采用MGIT（mycobacteria growth indicator tube）960液体和比例法固体药敏试验分别对所选15种药物：异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)、链霉素（S）、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)、莫西沙星(Mfx)、氧氟沙星（Ofx）、左氧氟沙星(Lfx)、对氨基水杨酸(PAS)、乙硫异烟胺（Eto）、丙硫异烟胺(Pto)、环丝氨酸(Cs)进行药敏实验。 结果Spoligotyping分型法确定了在25株TBM临床分离株中有20株为北京基因型,占80.0%（20/25）,２株为T1基因型,另外3株分别为T2型、LAM6型及未知型;VNTR有2株成一簇,基因型一样;25株TBM分离株中耐多药结核性脑膜炎（MDR-TBM）占12.0%（3/25）,广泛耐药结核性脑膜炎（XDR-TBM）占4.0%(1/25),耐氟喹诺酮类的菌株占8.0%(2/25),都属于北京基因型;任意耐药的菌株占48.0%(12/25),其中83.3%（10/12）为北京基因型;全敏感者占52.0%(13/25),其中76.9%(10/13)为北京基因型。 结论北京基因型在耐药TBM中所占比例很高,尤其是MDR-TBM,较其他基因型更易引起脑脊液生化的改变;耐氟喹诺酮类的菌株所占比例最少,提示临床上氟喹诺酮类药物对治疗TBM会有很好的疗效。