丙型肝炎病毒调节基因结合蛋白的研究

0 引言 丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,其基因组的长度约10千碱基对(kb),其中含有唯一的开放读码框架(ORF)1-4].在其基因组RNA翻译起始点的上游,有一段341个核苷酸(nt),称为5'非翻译区(5'-NTR),控制着HCV基因组的翻译过程[5-7].HCV的3'-非翻译区(3'-NTR)的核苷酸序列自身能够相互结合以形成复杂的二级结构,与一系列蛋白质因子结合,形成病毒复制过程所必须的复制酶(replicase)复合物[8-10].HCV 3'-NTR结合的蛋白质因子除了其自身编码的RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B)以外,还能够与感染宿主细胞的某些蛋白进行结合,以决定HCV的复制过程.HCV还必须借助病毒感染的靶细胞的一些蛋白质分子[11-13].     

丙型肝炎病毒蛋白结合蛋白

0引言丙型肝炎病毒(HCV)是1989年Choo et al应用分子生物学技术克隆成功的一个RNA病毒,属黄病毒科.可以引起慢性肝炎?肝硬化及肝癌,目前全世界有1.7亿人感染,干扰素联合利巴韦林是其治疗药物,但是疗效不佳[1-9].目前正在积极研究其发病机制,探索新的治疗方案.HCV的宿主范围较窄,只能在人及黑猩猩中繁殖,为研究带来困难.目前机制的研究限于体外的细胞模型或转基因动物.HCV是怎样与宿主细胞相互作用的,世界上进行了广泛的研究,特别是HCV各蛋白组分(C?E1?E2?P7?NS2?NS3?NS4a?NS4b?NS5a和NS5b)[10]与人体蛋白之间的相互作用,为HCV…     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白

0 引言1989年应用分子生物学技术发现了丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV),并证实可导致肝脏慢性疾病,是输血后肝炎的主要病因.全世界有1.7亿人感染 HCV,面临肝硬化和肝细胞癌的威胁.随着基因组测序工作的完成,随后就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能     

丙型肝炎病毒核心蛋白DNA结合区的测定

目的 阐明丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的DNA结合特性及其意义。方法 在大肠杆菌中表达谷胱甘肽转移酶（GST）融合HCV核心蛋白不同长度片段,并进行纯化。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过更换缓冲液的方法将这些蛋白片段相对固定在凝胶中,用γ－^32P[4667-0091]ATP标记人工合成的DNA进行2次电泳,通过放射自影检测核心蛋白的DNA结合区。结果 HCV核心蛋白N端第10－16位氨基酸残基和第46－70位氨基酸残基可独立地结合DNA,核心蛋白既能和单链DNA结合又能和双链DNA结合,对单双链DNA的结合域相同。对所结合的DNA序列无选择性。结论 HCV核心蛋白的N端含有两个DNA结合区,结合区序列与核内转移信号的部分重迭以及对结合靶DNA序列的非选择性可能是HCV核心蛋白具有多功能的基础。     

牛丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究

目的　利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论 ,应用生物信息学技术和方法 ,克隆牛丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白结合蛋白 6 (HCBP6 )的同源基因。方法　首先应用酵母双杂交技术 ,以表达HCV核心蛋白的表达载体为诱饵 ,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选 ,首先获得人HCBP6的全长编码基因 ,然后应用美国国立生物信息学中心 (NCBI)建立的核苷酸序列数据库 (GenBank)的同源基因的检索 ,搜索与之同源的来源于牛的表达序列标签 (EST)。然后根据基因同源性的原则 ,确定牛HCBP6的同源基因。结果　获得了与HCV核心蛋白结合蛋白的 36个基因片段 ,其中之一命名为HCBP6。根据基因同源性搜索 ,获得了来源于牛的EST基因序列片段 ,最终确立了牛HCBP6的同源基因。结论　利用不同物种之间基因同源性的原理 ,NCBI数据库GenBank同源基因的搜索 ,获得了牛HCBP6同源基因。生物信息学技术在后基因组时代具有重要地位和作用。     

丙型肝炎病毒基因分型研究

采用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）法检测了泰安地区４６例输血后丙型肝炎（ＰＴＨ－Ｃ）患者的血清ＨＣＶ－ＲＮＡ〉对其中３４例生进物ＰＣＲ产物用限制性长度多生分析泊（ＲＦＬＰ）进行了ＨＣＶ基因分型。结果ＨＣＶ－Ⅱ型检出率为７３．５％，ＨＣＶ－Ⅲ型检出率为１１．８％；ＨＣＶⅡ／ＨＣＶⅢ型混合感染率为１４．７％，未发现Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ型感染。     

乙型和丙型肝炎病毒对主要组织相容性复合体基因的调节

众所周知，免疫学上把能引起强而迅速排斥反应者称为主要组织相容性抗原，其编码基因是一组紧密连锁的基因群，称之为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)。MHC在不同的哺乳动物中有不同的命名，但是其组成、结构以及编码产物的功能等却很相似。人主要组织相容性抗原称为人白细胞抗原系统(human leucocyte antigen，HLA)。     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 扩增人胰腺cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y 187.诱饵质粒pGBKT7-core转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行序列比对.结果 筛选出11种与HCV核心蛋白相结合的蛋白基因,包括胰凝乳蛋白酶原B1前体、羧肽酶A1,胰蛋白酶原2、胰凝乳蛋白C、胰蛋白酶1,羧肽酶B1、驱动蛋白家族3B、胰蛋白酶2,线粒体蛋白基因、弹性蛋白酶3A,辅脂肪酶.结论 在筛选出的HCV核心蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与糖,脂代谢密切相关.     

丙型肝炎病毒核心基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫用于预防和治疗ＨＣＶ感染的可行性和有效性．方法将ＨＣＶＣ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游，在证实其可以在小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０（Ｈ２ｄ）中表达之后，将重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）小鼠股四头肌，ＥＬＩＳＡ检测血清中抗体产生水平；３ＨＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠淋巴细胞ＨＣＶＣ抗原特异性增殖能力，４ｈ５１Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能．结果免疫小鼠２０只，初次免疫２ｗｋ后，血清中均出现了ＨＣＶＣ抗体，且增加免疫剂量可提高抗体滴度；淋巴细胞增殖指数为６１０，明显高于对照组（Ｐ＜００１），ＣＴＬｓ体外特异性杀伤率为６３１％，也高于对照组（Ｐ＜００１）．结论ＨＣＶＣ基因免疫不仅可以诱导机体产生特异性的体液免疫，而且产生特异性的细胞免疫，它可能是防治ＨＣＶ的有效方法．     

西安地区丙型肝炎病毒基因分型研究

目的　了解西安地区不同人群ＨＣＶ 基因型分布．方法　先用逆转录－ 套式多聚酶链反应检测抗－ ＨＣＶ 阳性血清的ＲＮＡ, 阳性者再用限制性片段长度多态性分析法进行ＨＣＶ 基因分型．结果　１１３ 份ＨＣＶＲＮＡ 阳性血清的基因型如下：输血后丙肝组,Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅱ／ Ⅲ混合型分别为８０ ％ ,１６－７ ％ 和３－３ ％ ．散发性丙肝组,Ⅱ型、Ⅲ型分别为７８－９ ％ 和２１－１ ％ ,未检出Ⅱ／Ⅲ混合型． 肝硬变组, Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅱ／ Ⅲ混合型分别为８７－９ ％ ,９－１ ％ 和３ ％ ． 原发性肝癌组,Ⅱ型、Ⅲ型分别为８７－１ ％和１２－９ ％ ,未检出Ⅱ／ Ⅲ混合型． 分型总结果为：ＨＣＶⅡ型、Ⅲ型及Ⅱ／ Ⅲ混合型分别为８４－１ ％ ,１４－２ ％ 和１－７ ％ ．结论　ＨＣＶⅡ型是西安地区优势株． 不同人群中ＨＣＶ 基因型总体分布差异无显著性．     

乙型和丙型肝炎病毒蛋白对于细胞周期素A的调节研究

0 引言细胞周期(cell cycle)是细胞分裂增生的经典概念,过去的研究主要集中在细胞周期的形态学描述上。随着细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖性激酶(cyclin dependentkinase,CDK)的发现及其作用机制的研究进展,使得我们对于细胞周期调节有了分子生物学水平上的深入     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVE2蛋白反式调节相关基因。方法以HCVE2表达质粒pcDNA3.1(-)_E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVE2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1000bp插入片段。挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中。结论应用SSH技术成功构建了HCVE2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白激酶R的功能区域研究

目的 构建并表达丙型肝炎病毒(HCV)不同病毒株：癌中心株(BT)、癌旁珠(BNT)、HCV-J及BT不同截短片段谷胱甘肽(GST)-核心融合蛋白；寻找核心蛋白(Core)与蛋白激酶R(PKR)相互作用区域，探讨它们在HCV持续感染及肝细胞癌(HCC)发病机制中的作用。方法 用聚合酶链反应扩增不同片段HCV核心蛋白基因，并将7个不同的基因片段分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，诱导表达并纯化表达蛋白，与两株细胞(HepG2和Huh-7)的PKR进行相互作用试验。结果7个不同片段Core在体外都得到相应表达，不同片段结合PKR的能力存在一定差异。BT、BNT、C191的Core N端1～172氨基酸(aa)3个片段均能与PKR发生直接结合，BT与PKR结合的区域在Core N端的1～58aa。结论 不同片段Core在原核细胞中获得较好的表达；Core／PKR相互作用，在HCV持续感染和HCC的发病机制中可能起重要作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白致癌作用的研究

研究表明丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白可能具有潜在的直接致癌作用。应用腺相关病毒载体介导的病毒重组技术,成功观察到HCV核心蛋白诱发的肝癌形成。 1.材料和方法:(1)HCV core区基因克隆及测序:按文献[1]方法进行,各种工具酶等购自美国Promega公司。②含HCV core区重组腺相关病毒的制备:将腺相关病毒载体质粒PSSHG(西安交通大学医学院解剖教研室构建惠赠)和HCV