软骨细胞—支架复合物修复兔耳廓软骨缺损

目的在有免疫力的动物兔体内探索组织工程化软骨对软骨缺损的修复能力。方法软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后修复兔耳廓软骨缺损，与对照组比较，并从大体及组织学进行评价。结果软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后回植到兔耳廓软骨缺损部位，软骨缺损得到修复，但与正常软骨交界处为纤维组织。注射软骨细胞悬液、以聚羟基乙酸支架修复及空白对照组软骨缺损均未修复。结论软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后在有免疫力的动物兔体内可修复耳廓软骨缺损，但存在着界面愈合问题。     

软骨细胞—支架复合物修复兔耳廓软骨缺损

目的在有免疫力的动物兔体内探索组织工程化软骨对软骨缺损的修复能力。方法软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后修复兔耳廓软骨缺损,与对照组比较,并从大体及组织学进行评价。结果软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后回植到兔耳廓软骨缺损部位,软骨缺损得到修复,但与正常软骨交界处为纤维组织。注射软骨细胞悬液、以聚羟基乙酸支架修复及空白对照组软骨缺损均未修复。结论软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后在有免疫力的动物兔体内可修复耳廓软骨缺损,但存在着界面愈合问题。     

软骨细胞—支架复合的修复兔耳廓软骨缺损

目的 在有免疫力的动物兔体内探索组织工程化软骨对软骨缺损的修复能力。方法 软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后修复兔耳廓软骨缺损，与对照组比较，并从大体及组织学进行评价。结果 软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后回植到兔耳廓软骨缺损部位，软骨缺损得到修复，但人骨交上为纤维组织。注射软骨细胞悬液、以聚羟基乙酸支架修复及空白对照组软骨缺损均未修复。结论 软骨细胞种于经不     

以PHBV为支架构建组织工程化软骨

[目的]探讨聚（羟基丁酸酯．羟基戊酸酯）（PHBV）多孔材料作为软骨组织工程支架的可行性以及体内外培养方式对软骨形成的影响。[方法]采用“压片-热处理-粒子析出”技术制备PHBV多孔支架。体外分离培养软骨细胞后接种到PHBV支架体外培养2周，期间扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况，然后与单纯PHBV支架同植入裸鼠皮下继续培养4、8周后取材，与体外培养至6、10周的细胞一支架复合物同行组织学观察。[结果]电镜观察示软骨细胞在支架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质；组织学观察示PHBV浅层有新生软骨组织形成，且皮下培养的软骨组织比体外培养的更为成熟。单纯PHBV支架皮下培养没有软骨组织形成。[结论]PHBV可以作为软骨组织工程支架材料。体内培养较体外更有利于组织工程化软骨的形成。     

组织工程骨软骨复合物的构建与形态学观察

目的探讨采用组织工程技术构建骨软骨复合物的可行性。方法将骨髓基质细胞(BMSCs)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)构建组织工程软骨，经成骨诱导的BMSCs接种于聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(PLGA／TCP)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明。组织工程软骨在体内可形成软骨组织组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。结论以骨髓基质细胞为种子细胞、以快速成形的生物降解材料为支架体外构建的组织工程骨软骨复合物，可在体内形成骨软骨组织，有望用于骨软骨缺损的修复。     

力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化

目的：研究不同的应力刺激对软骨细胞与骨髓基质干细胞（BMSCs）共培养体外构建组织工程化软骨的影响。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞,二者按7：3比例混和,以5．0×107／ml的细胞密度接种于聚羟基乙酸（PGA）支架上,一周后根据不同的施加力分为4组：离心组、摇床组、搅拌组,静止培养作为对照组。6周后取材行相关检测。结果：三受力组形成的细胞材料复合物基本保持原来的体积与外形。HE染色结果显示大量成熟软骨陷窝形成,细胞外基质沉积均匀;Safranin-O及甲苯胺兰染色显示有大量的GAG形成,免疫组化检测II型胶原表达强阳性。三受力组标本组织湿重、体积、GAG含量等指标均优于对照组。结论：力学刺激有利于促进少量软骨细胞与BMSCs共培养体外软骨分化;并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。     

兔阴囊原位构建组织工程化睾丸假体的实验研究

目的探讨以HDPE-PGA复合支架接种兔耳软骨细胞后,于兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体的可能性。方法取成年兔耳软骨分离培养软骨细胞,制备HDPE-PGA复合支架,细胞-支架复合物体外培养2w。摘除单侧兔睾丸后即时将经体外培养的细胞-支架复合物植入阴囊原位,术后3m将兔处死取材。单纯支架植入为对照组。标本行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化、GAG含量检测。结果实验组取材标本经检测具有预制形态与体积,有新生软骨组织产生,软骨组织呈岛状分布,其间有不同程度的纤维组织长入及炎性细胞浸润。对照组无软骨形成。结论兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体具有预制形态与体积、结构与组织学形态良好。     

组织工程技术修复兔气管软骨缺损的实验研究

目的探讨以兔耳廓软骨细胞(auricularchondrocytes)为种子细胞,利用组织工程技术修复其自体气管软骨缺损的可行性。方法取兔耳廓软骨,以II型胶原酶消化分离软骨细胞,体外培养并扩增至第2代后,接种于聚羟基乙酸(PGA)纤维支架(3cm×2cm,约60mg),形成细胞—材料复合物。体外培养7d后,细胞—材料复合物环行包裹于直径为0.7cm的硅胶管外表面,置于裸鼠皮下。6周后取出,并将形成的管状软骨用于修复兔自体约1.5cm长的节段性气管软骨全层缺损。结果兔耳廓软骨细胞有较强的体外增殖能力,扩增至第2代时即可满足组织构建所需要的细胞量。软骨细胞种植于PGA后,细胞和材料黏附良好,细胞外基质分泌旺盛。置于裸鼠皮下6周后,细胞—材料复合物可形成弹性、韧性良好的管状软骨;其大体外观,组织学结构均与兔自体气管软骨相似。修复兔气管缺损后,组织工程化气管和周围组织愈合良好,实验动物可自主呼吸,成活1~28d不等,平均12.3d,死亡原因多为痰液积存和气管内肉芽增生。结论以兔耳廓软骨细胞与PGA相复合,利用组织工程学技术可以形成大体外观、组织学结构均与兔自体气管软骨相似的“组织工程化气管”,并能用于修复兔自体气管全层缺损。     

非降解聚氨酯弹性体支架材料体外构建残耳软骨用于修复耳廓组织的可行性

目的:探讨以非降解聚氨酯弹性体支架材料体外构建残耳软骨用于修复耳廓组织的可行性。方法:分离30例临床小儿畸形患者软骨细胞,经培养、扩增后制成细胞悬液滴加于圆盘状聚氨酯支架上,体外培养21d后接种于裸鼠体内培养42d,应用扫描电镜观察细胞-支架复合物生长情况,同时使用免疫组织化学法观察成软骨细胞冰冻切片情况。结果:软骨细胞体外培养3周后形成的细胞-支架复合物的形态学及组织学较正常耳廓软骨组织相差甚远,而在裸鼠体内培养6周的细胞-支架复合物外观光滑细腻,与正常耳廓软骨组织相近,经免疫组织化学法分析可见新生的软骨组织细胞间质中存在蓝黑色的丝网状弹力纤维。结论:聚氨酯材料能够成为组织工程耳廓软骨的支架材料,且体内培养较体外培养更利于软骨组织的生长。     

传代对残耳软骨细胞体内软骨形成能力的影响

目的：研究传代对残耳软骨细胞体内软骨形成能力的影响。方法分离培养人残耳软骨细胞,将第3-8代细胞分别复合聚羟基乙酸/聚乳酸支架,构建组织工程化软骨;体外培养4周后植入裸鼠体内观察8周。采用组织学染色观察各组标本的软骨形成情况;Real-time PCR检测软骨分化相关基因的表达;生物力学分析新生软骨的弹性模量。结果各代复合物体外培养4周时均不能形成软骨组织,但第3-5代残耳软骨细胞COL 2A1、第3-4代的SOX 9和第3代的DLK 1仍可维持较高的表达水平（P〈0.05）;体内植入8周后,第3-6代复合物均有不同程度的弹性软骨结构形成,并随代次增高而减少,第3-6代复合物的弹性模量明显高于第7、8代。结论残耳软骨细胞传至第4代仍能保持良好的体内软骨形成能力,但扩增传代对残耳软骨细胞软骨表型去分化的影响在第7代后已无法逆转。     

包埋后的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养实验研究

目的:通过卵磷脂和多聚赖氨酸分别和共同包埋以聚乳酸固定成形的聚羟基乙酸支架与软骨细胞体外培养,来观察其亲水性和对细胞吸附力的改变以及对细胞功能的影响。方法:将软骨细胞种于上述支架体外培养,通过倒置显微镜及扫描电镜观察支架的亲水性、对细胞的吸附力及基质产生情况。结果:支架以卵磷脂包埋后细胞悬液易浸入到支架内;以多聚赖氨酸包埋后细胞易吸附在支架纤维表面;以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋后细胞均匀分布于支架纤维之间及吸附在支架纤维表面,且基质产生旺盛。结论:卵磷脂具有增强支架亲水性作用;而多聚赖氨酸除增加支架对细胞的吸附力外,还具有促进细胞功能的作用。以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋支架可能是组织工程技术中较理想的支架之一。     

包埋后的几丁质与软骨细胞体外培养的实验研究

目的 探讨几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。方法 采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别或工同包埋几丁质与软骨细胞体外培养,观察其产亲水性的改变、对细胞吸附力和细胞功能的影响。结果 以聚乳酸包埋的几丁质对细胞的生长有抵制作用;以卵磷脂包埋的几柄质亲水性增强;以多聚赖氨酸包埋的几丁质对细胞吸附力增强;以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的几丁质具有良好的亲水性和对细胞吸附力,并可使细胞更好地发挥功能     

卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA包埋PGA与软骨细胞体外培养的实验研究

组织工程技术中细胞培养支架的选择是研究的焦点之一。以ＰＬＡ包埋的ＰＧＡ无纺网是应用较为广泛的支架之一。但其亲水性差，对细胞吸附力弱，是其不足之处。此实验选择了卵磷脂和多聚赖氨酸来分别和共同包埋ＰＧＡ＋ＰＬＡ，来观察其亲水性和对细胞吸附力的改变，及对细胞功能的影响。本实验证明卵磷脂具有增强支架亲水性作用；而多聚赖氨酸除具有增加支架对细胞的吸附力外，还具有促进细胞功能的作用。以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋支架使细胞均匀地分布于支架纤维之间和支架表面，充分利用了支架空间，从而更好地发挥细胞的功能。所以本实验将为组织工程技术中细胞培养支架的选择提供一条新的途径。     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

组织工程软骨体外构建的相关实验研究

目的 探索组织工程软骨体外构建技术体系可行性.方法 种子细胞选用胎儿软骨细胞(口服药物流产胎儿,胎龄3～6个月).酶消化法获得第1代细胞,以50×106/ml浓度均匀接种于经聚乳酸(PLA)包埋聚乙醇酸(PGA)高分子聚合物支架,形成细胞-支架复合体,在体外静态培养.分别于2周、4周、8周进行大体观察、扫描电镜及组织学检测.结果 体外构建的组织工程软骨,随培养时间延长,色泽由2周时的乳白色逐渐呈现半透明,8周时接近正常软骨外观.扫描电镜显示软骨细胞与材料具有良好相容性,培养7天PGA纤维之间有基质沉积.HE染色示2周有大量软骨陷窝形成和均匀嗜碱性基质分泌,Safranin'O染色示基质有酸性蛋白多糖分布,Massons's trichome染色示基质有胶原成分,但含量较少,经免疫组织化学检测为特异Ⅱ型胶原.培养4周胶原成分开始明显增多,软骨陷窝形态接近成熟,8周细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量丰富且分布均匀.结论 以成熟软骨细胞为种子细胞,运用组织工程技术在体外能构建出具有正常软骨组织结构特征的人组织工程软骨.     

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。 HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。     

同种异体软骨细胞与自体骨髓基质干细胞混合共培养构建软骨皮下移植的可行性研究

背景：软骨组织工程的种子细胞问题是目前研究的热点和难点,如何找到一种既能够避免对自体软骨进行取材又能够达到稳定软骨构建目的的方法呢？本研究尝试利用少量同种异体羊软骨细胞作为软骨诱导微环境提供者,与扩增后的羊自体BMSC混合共培养并植入皮下环境,探讨利用同种异体软骨细胞共培养构建软骨皮下移植的可行性。方法：本实验对山羊软骨细胞和BMSC分别进行取材和分离培养扩增,并将以上细胞分为以下四组进行混合并接种在PGA支架材料上：A组：100%自体软骨细胞;B组：30%自体软骨细胞＋70%自体BMSCs;C组：30%同种异体软骨细胞＋70%自体BMSCs;D组：100%同种异体软骨细胞。经过体外构建6周后植入羊皮下进行体内构建12周,对所形成的组织块进行大体观察和组织学染色等评价。结果：自体软骨细胞组和自体软骨细胞混合自体BMSC组皮下移植后可见成熟软骨组织形成,但同种异体软骨细胞参与的两组（包括同种异体软骨细胞混合自体BMSC的实验组和单纯异体软骨细胞组）在皮下环境中都因为较强的免疫反应未能形成软骨组织。结论：同种异体软骨细胞以及PGA支架材料的存在对于组织工程软骨在羊皮下环境的构建有负面影响。     

聚羟基丁酸酯载体人工软骨体内培育的实验研究

目的 探讨聚羟基丁酸酶（ＰＨＢ）泡沫材料作为软骨细胞支架材料以及体内培育组织工程化人工软骨的可行性。方法 取４周龄雄性新西兰幼免关节软骨、胶原酶消化,将所获软骨细胞种植到ＰＨＢ泡沫材料上,体外培养１周后,将细胞－支架材料复合体移植到兔背背部下皮,以单纯植入聚羟基丁酸酯泡沫材料及接种软骨细胞组为对照组。分别于术后第４、８、１２周取材,进行大体观察及组织学、免疫组织化学观察。结果 软骨细胞＝支架材料复