PFGE法分析多血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒

目的:对从食物中毒样品中分离到的7株副溶血性弧菌作常规鉴定及脉冲场凝胶电泳(PFGE)同源性分析,以明确致病因子。方法:按GB/T4789.7-2008进行副溶血性弧菌分离、生化鉴定、神奈川试验、血清分型;Pulse-Net PFGE分子分型标准实验室操作方法作同源性分析。结果:7株副溶血性弧菌分成三个血清型,即O3∶K6型5株,O4∶K8型和O1∶K56型各1株,分别属于三种不同的PFGE条带型,其中6株菌神奈川试验阳性。结论:这次食物中毒可能为以O3∶K6型为主的不同克隆群副溶血性弧菌混合感染所致。     

PulseNet USA standardized pulsed-field gel electrophoresis protocol for subtyping of Vibrio parahaemolyticus

PulseNet is a national molecular subtyping network for foodborne disease surveillance composed of public health and food regulatory agencies. Participants employ molecular subtyping of foodborne pathogens using a standardized method of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for conducting laboratory-based surveillance of foodborne pathogens. The PulseNet standardized PFGE protocols are developed through a comprehensive testing process. The reproducibility of the protocol undergoes an internal evaluation at the Centers for Disease Control and Prevention and an external evaluation in multiple PulseNet laboratories. Here we describe the development and evaluation of a rapid PFGE protocol for subtyping Vibrio parahaemolyticus for use in PulseNet activities. The protocol was derived from the existing standardized PulseNet protocols for Escherichia coli O157:H7 and Vibrio cholerae. An external evaluation of this protocol was undertaken in collaboration with three PulseNet USA participating public health laboratories. Comparative analysis of the PFGE fingerprints generated by each of these laboratories demonstrated that the protocol is both reliable and reproducible in the hands of multiple users.     

水产品中副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型

目的 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对水产品中副溶血性弧菌进行分子分型。方法 采用PFGE技术,对80株分离自11个国家和中国浙江省和山东省的水产品中的副溶血性弧菌进行分子分型;基因组DNA用Not I和Sfi I 2种酶进行消化。结果 Not I和Sfi I 2种内切酶均得到68种带型,综合系统树图中分成70种带型;Not I和Sfi I的分辨率分别为78.8%和76.3%;14株来自加拿大的菌株分聚成相似度100%的4组,其中有4株菌和10株菌分别聚成相似度91.8%和93.3%的2组;挪威和新西兰分别有3株和2株菌相似度为100%;其他国家的菌株无与本国相同的菌株。结论 2种酶均适合于副溶血性弧菌的PFGE分型,Not I的效果略好于Sfi I;菌株间的亲缘关系与来源地无明显关联,但具有毒性基因的菌株更易在系统发育树上处于较近的分枝上。     

沈阳地区副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳分析

目的 运用脉冲场凝胶电泳技术(pulsed-fieldgelelectro phoresis,PFGE)和PCR技术对辽宁沈阳市2010年7-8月份临床粪便标本分离的副溶血性弧菌进行毒力基因检测和分子分型分析.方法 运用PCR技术检测24株副溶血弧菌的耐热溶血素基因(tdh)、耐热溶血素相关溶血素基因(trh)和不耐热溶血素基因(tl);用PFGE技术对其进行分子分型和聚类分析.结果 24株副溶血弧菌均含有tdh和tl基因,表明均为有毒株;PFGE结果显示,24株菌株可分为10种图谱型,其中17株O3:K6被分为4种型别(仅相差1～3条带),表明17株O3:K6在流行病学上密切相关,提示沈阳地区可能存在副溶血弧菌腹泻病的局部暴发或流行.结论 沈阳地区流行的食源性副溶血弧菌存在基因型的多样性,但以遗传关系密切的O3:K6型为优势型别.     

脉冲场凝胶电泳分子分型方法用于霍乱弧菌相关性分析

目的用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型方法,分析辽宁丹东和广东珠海两地区从水体和水产品中分离的霍乱弧菌之间的相关性。方法对39株霍乱弧菌用内切酶Not I酶切DNA后进行PFGE分子分型,并在0.5×TBE电泳缓冲液中加入终浓度为3.8 mg/L的硫脲溶液电泳。结果所有39株霍乱弧菌的基因组DNA显示出良好的分型结果,从朝鲜排污口、丹东鸭绿江水体中的鲫鱼、河蟹以及丹东排污口分离出的霍乱弧菌之间的相似度达到100%,说明这些产品之间应为同一个污染源;珠海的大头鱼和鳙鱼之间的相似度达到100%,说明这两者之间应为同一个污染源;珠海鲫鱼中检出的霍乱弧菌和鸭绿江水体中检出的霍乱弧菌之间的相似度达到88.4%,说明这两者之间可能为同一个污染源。结论PFGE技术适用于霍乱弧菌环境样品分离菌株的相关性分析和传染源的追踪。     

用脉冲场凝胶电泳方法对O139霍乱弧菌分型的研究

目的：利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术探讨O139群霍乱弧菌的分子分型方法。方法：用SfiⅠ酶和NotⅠ酶切O139群霍乱弧菌染色体DNA，经脉冲场凝胶电泳进行片段分离。结果：14株O139群霍乱弧菌经SfiⅠ酶切后电泳分离可得一个PFGE型，用NotⅠ酶切电泳可分为2个PFGE型。结论：脉冲场凝胶电泳技术分析O139群霍乱弧菌，分型发现微小差别有助于分析追踪疫情和来源。     

副溶血性弧菌tdh基因的分子信标PCR技术检测

目的采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测。方法在反应体系中加入分子信标探针。对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测。结果2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114．9，95．2，90．0。实时PCR检测的CT值分别为26．2，26．8，32．0。其他肠道细菌终点法检测荧光值为47．0～69．1；CT值〉32．0或无值，与琼脂糖电泳分析结果一致。结论分子信标PCR技术可以准确、快速、实时、简便地进行副溶血性弧菌tdh基因检测。     

副溶血性弧菌蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立

目的:建立副溶血性弧菌蛋白质分离的双向电泳技术。方法:分析比较两种不同的副溶血性弧菌蛋白制备方法,样品纯化后,选择不同pH范围IPG胶条,双向电泳,蓝银染色,比较图片。结果:超声裂解法效果较好且操作简便快速,提取出来的蛋白质经过纯化处理后再进行双向电泳效果较好,该细菌蛋白质点主要集中在pH4.5～5.5之间,还有部分分布在pH6～7之间。结论:建立了副溶血性弧菌蛋白质双向凝胶电泳技术,为后续研究奠定了基础。     

广州地区小川型霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的分析小川型霍乱弧菌的致病相关基因型,探讨广州地区小川型霍乱流行趋势和规律。方法采用多重PCR方法检测小川型菌株的4种致病相关基因,应用脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）对菌株进行分子分型,对PFGE图谱采用分子分型软件BioNumerics Version 4.0进行聚类分析。结果广州地区小川型菌株中存在3种致病相关基因型,即A型、B型和C型,20%感染者分离株为致病相关基因A型,80%环境分离株为致病相关基因C型。25株霍乱弧菌分为14个不同的PFGE型,归为3个聚类群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群）。每一次小川型暴发中分离的菌株PFGE克隆型相同或相近,而散发病例分离株与暴发株的PFGE型有些相同,有的差异较大。环境小川型菌株中存在PFGE克隆型的多样性,部分环境株与感染者分离株具有相近的PFGE型。结论应建立广州地区霍乱菌株的PFGE分子分型数据库,加强霍乱的预防、控制和预警。     

Molecular typing of Vibrio cholerae O1 isolates from Thailand by pulsed-field gel electrophoresis

The aim of the present study was to genotypically characterize Vibrio cholerae strains isolated from cholera patients in various provinces of Thailand. Two hundred and forty V. cholerae O1 strains, isolated from patients with cholera during two outbreaks, i.e. March 1999-April 2000 and December 2001-February 2002, in Thailand, were genotypically characterized by NotI digestion and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). In total, 17 PFGE banding patterns were found and grouped into four Dice-coefficient clusters (PF-I to PF-IV). The patterns of V. cholerae O1, El Tor reference strains from Australia, Peru, Romania, and the United States were different from the patterns of reference isolates from Asian countries, such as Bangladesh, India, and Thailand, indicating a close genetic relationship or clonal origin of the isolates in the same geographical region. The Asian reference strains, regardless of their biotypes and serogroups (classical O1, El Tor O1, O139, or O151), showed a genetic resemblance, but had different patterns from the strains collected during the two outbreaks in Thailand. Of 200 Ogawa strains collected during the first outbreak in Thailand, two patterns (clones)--PF-I and PF-II--predominated, while other isolates caused sporadic cases and were grouped together as pattern PF-III. PF-II also predominated during the second outbreak, but none of the 40 isolates (39 Inaba and 1 Ogawa) of the second outbreak had the pattern PF-I; a minority showed a new pattern--PF-IV, and others caused single cases, but were not groupable. In summary, this study documented the sustained appearance of the pathogenic V. cholerae O1 clone PF-II, the disappearance of clones PF-I and PF-III, and the emergence of new pathogenic clones during the two outbreaks of cholera. Data of the study on molecular characteristics of indigenous V. cholerae clinical isolates have public-health implications, not only for epidemic tracing of existing strains but also for the recognition of strains with new genotypes that may emerge in the future.     

布鲁菌脉冲场凝胶电泳图谱分型方法建立

目的 建立我国95株布鲁菌的染色体DNA脉冲场凝胶电泳图谱,进行布鲁菌的分子遗传学分类鉴定。方法 选择我国不同地区、不同时限分离的布鲁菌100株(包括19株标准布鲁菌株),应用SeaKem Gold琼脂糖胶块纯化布鲁菌完整的染色体DNA,限制性内切酶XbaI消化后,进行脉冲场凝胶电泳分离(PFGE)。结果 XbaI酶切布鲁菌基因组DNA后,可产生20~500kbp范围的15~25条酶切片段,并可以在PFGE凝胶上被很好的区分开。PFGE可在种的水平上区分布菌各种标准株,76株中国分离株可被分为39种PFGE类型,并聚为4大类。PFGE与传统分型方法比较,2者的一致性达63%。结论 脉冲场凝胶电泳图谱可对布鲁菌进行遗传学分类鉴定,在布鲁菌的分子流行病学研究中具有重要意义。     

采用脉冲场凝胶电泳和自动化核糖体分型技术分析MPN法分离出的副溶血性弧菌的同源性

目的对15管MPN法分离的78株副溶血性弧菌进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)和自动化核糖体分型(RP)研究,以确定其同源性。方法EcoRⅠ酶切DNA进行核糖体分型;限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ在50℃和37℃酶切包被的染色体DNA,进行脉冲场凝胶电泳分析,两者的结果均用BioNumerics软件进行聚类分析。结果78株副溶血性弧菌用EcoRⅠ、SfiⅠ、NotⅠ酶切后各产生64、68、71种带型,同一样品中分离的菌株有的带型完全相同,但大部分带型不同,且划分到不同的群中。结论PFGE是一种快速、有力、重复性好的分型技术,而且分辨能力要高于核糖体分型;在今后的溯源研究中,要考虑对可疑食品采用MPN定量法挑取多个菌落进行亲缘关系分析,防止漏检。     

沙门菌脉冲场凝胶电泳分型研究

目的为研究河北省食品中污染的主要沙门菌菌株间的同源关系,特建立了脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法,通过PFGE分型研究在我省建立沙门菌DNA指纹图谱基因库,以便将来对不同来源的沙门菌DNA图谱进行即时比较,确定同源性,进而确定食源性疾病的传染源、传播途径、流行范围等,为从根本上防止食源性疾病的发生提供技术基础.方法对2005～2007年间我省食源性致病菌监测网从各类食品样品中分离出的7种主要沙门菌(山夫登堡沙门菌、鸭沙门菌、阿贡纳沙门菌、猪霍乱沙门菌、德比沙门菌、伊鲁木沙门菌、肠炎沙门菌),用蛋白酶K和TE缓冲液提取菌体DNA后,用Xba I限制性内切酶消化胶块,然后在CHEF-DRⅢ型仪器上进行脉冲场凝胶电泳,电泳条件为0.5 ×TBE电泳缓冲液、冷却温度14℃、initial switch 2.16 8,final switch 63.8 8,time17hours,angle=120,6volt/cm.应用H9812作为脉冲场凝胶分子量标准.结果我省7种主要沙门菌存在的PFGE型别较多,各菌株间亲缘关系较远,在同种沙门菌间相似性系数最小值为4.4%,但也有同源菌株存在.结论7种主要沙门菌均未显示流行趋势,同时也表明PFGE是一种灵敏、可靠的研究沙门菌分子流行病学的基因分型方法.     

副溶血性弧菌热稳定直接溶血素基因转录水平差异研究

目的 运用实时荧光定量 PCR 检测24株副溶血性弧菌热稳定直接溶血素（TDH）基因转录水平差异。方法 普通 PCR 法检测分离自患者、海产品和环境中的副溶血性弧菌 tdh 基因,tdh 阳性菌株提取细菌总 RNA 后逆转录合成 cDNA,检测无 DNA 污染后定量至同一浓度,采用实时荧光定量 PCR 同时检测 cDNA 产物中 tdh 基因和内标基因16 S rRNA 的 Ct 值,ΔCt 等于 tdh 的 Ct 值减去16 S rRNA 的 Ct 值,以ΔCt 值反应 tdh 相对于内标基因16 S rRNA 的转录水平。结果 24株副溶血性弧菌的 tdh Ct 值、内标基因16 S rRNA Ct值和各样本两者之差的ΔCt 值结果范围分别为18.04～25.95、8.30～10.93和8.28～15.34,ΔCt 最大值与最小值差为7.06,最高转录水平菌株为最低菌株的133倍（ΔΔCt ＝27.06）。结论 副溶血性弧菌 tdh 基因转录水平存在较大差异,该差异性形成的分子机制以及与该菌的致病性的关系有待进一步研究。     

不同来源副溶血性弧菌血清群耐热直接溶血素及耐药性研究

摘要：目的　了解不同来源副溶血性弧菌血清群分布,耐热直接溶血素携带情况及耐药性状况。方法　利
用血清凝集试验进行血清群检测;利用荧光定量ＰＣＲ 仪进行耐热直接溶血素检测;采用纸片扩散法进行
１１种抗生素药物敏感试验;采用χ
２ 检验进行统计学分析。结果　副溶血性弧菌食物中毒和肠道门诊分离
株血清群以Ｏ３和Ｏ４为主,水产品分离株无优势血清群。副溶血性弧菌食物中毒和肠道门诊分离株耐热直
接溶血素检出率均达９０％以上,经χ
２ 检验差异无统计学意义（χ
２＝０．０３,ν＝１,犘＝０．８６）。副溶血性弧
菌水产品分离株耐热直接溶血素检出率为０。６２ 株副溶血性弧菌对氯霉素、四环素和复方磺胺甲 唑
１００％敏感。结论　副溶血性弧菌食物中毒和肠道门诊分离株与水产品分离株的血清群和耐热直接溶血素存
在较大差异。抗生素首选氯霉素、四环素和复方磺胺甲唑。
关键词：副溶血性弧菌;血清群;耐热直接溶血素;耐药
中图分类号：Ｒ３７８．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０６ ０６０８ ０４     

应用脉冲场凝胶电泳分型技术溯源副溶血弧菌食物中毒

目的应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对副溶血弧菌食物中毒进行分析。方法采用限制性内切酶NotⅠ,对一起广州市某餐厅副溶血弧菌食物中毒中30株副溶血弧菌进行PFGE分子分型,用BioNumerics Version4．0软件（复选Dice相关系数和UPGMA方法）进行聚类分析。结果分离的30株副溶血弧菌特异性toxR基因均为阳性,毒力基因tdh阳性,而trh阴性。30株副溶血弧菌PFGE型别相同。结论PFGE分型可揭示人、食品和公用具分离的副溶血弧菌菌株之间的流行病学联系,为疫情溯源提供分子流行病学证据和支持。     

深圳市1993-2002年霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的 分析深圳市1993—2002年霍乱弧菌菌株的相关性。方法 60株霍乱弧菌基因组DNA经Not Ⅰ酶切，通过脉冲场凝胶电泳获得电泳图谱，利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果 60株霍乱弧菌被分为39种脉冲场凝胶电泳图谱，聚类分析将大部分菌株分为A、B两群。结论 深圳地区霍乱弧菌存在紧密相关的流行克隆群。霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析，有助于霍乱的主动监测和传染来源追踪。     

肠炎沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分型研究

目的　为研究肠炎沙门氏菌菌株间的关系,特建立了分子流行病学研究方法脉冲场凝胶电泳分型方法,并对从食品中分离的肠炎沙门氏菌进行了分型研究。方法　1991～2 0 0 1年间,从河南、黑龙江等省份采集食品样品,分离出肠炎沙门氏菌,挑取单个菌落增菌,用溶菌酶、蛋白酶K和TE缓冲液依次提取菌体DNA后,用限制性内切酶XbaΙ消化胶块,然后在CHEFMapper仪上进行脉冲场凝胶电泳,电泳条件:0 . 5×TBE缓冲液、14℃、1%琼脂糖、脉冲时间5s～4 5s、2 6h、6V cm。应用λ噬菌体DNA作为脉冲场凝胶分子量标准。结果　从鸡肉、牛肉、熟肉及蔬菜中分离出30株肠炎沙门氏菌,其中18株来自河南省,绝大多数菌株(2 2株)分离于2 0 0 1年。对所得菌株进行脉冲场凝胶电泳后,结果显示30株肠炎沙门氏菌分为A、B两个型,两型图谱之间有8个条带的差异。A型菌株有19株,占全部菌株的6 3. 3% ,B型菌株有11株,占36 .7%。A型之内又可以分出2个亚型,其中A1型占78 .9% ,A2亚型与A1亚型相比的差别在于,A2型在5 0kb处有一条带缺失。在菌株分型与采集时间和采集地点之间没有相关性,但所有从鸡肉中分离到的菌株均为A1型,提示了某种有待进一步研究的流行病学趋势。结论　在研究肠炎沙门氏菌不同菌株之间的分子流行病学关系方面,脉冲场凝胶电泳是一种有     

Epidemiological typing of bovine streptococci by pulsed-field gel electrophoresis

Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was used to investigate the epidemiology of streptococcal mastitis in dairy cattle. The most prevalent streptococcal species, Streptococcus uberis (60-80% of streptococcal isolates), was highly heterogeneous, with different cows only rarely sharing the same pulsotype. S. agalactiae was rarely encountered, however all eight isolates from one farm generated identical PFGE profiles, which differed from those of all other isolates examined, confirming cow-to-cow transmission. Fifty-two isolates of S. dysgalactiae from 27 cows on 5 farms generated 6 different profiles. However, on individual farms, only one or two pulsotypes usually predominated. This species is generally regarded as an environmental pathogen but our data suggest that cow-to-cow transmission of S. dysgalactiae may occur. In spite of the variation in PFGE profiles of isolates from different cows, persistent infections in individual cows were usually caused by the same pulsotype of S. uberis or S. dysgalactiae.     

江苏省1999—2005年霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的了解江苏省1999-2005年间分离的霍乱弧菌核酸特征,及O139群与O1群霍乱弧菌在基因组水平上的关联。方法 NotⅠ酶切霍乱弧菌基因组,脉冲场凝胶电泳(PFGE)得到指纹图谱,并进行比较分析。结果 PFGE指纹图谱将全部136株霍乱弧菌分为6类,PFGE-A型由1株临床来源El Tor、120株临床来源和9株环境来源的O139组成,PFGE-B型由1株临床来源的El Tor组成,PFGE-C型由1株临床来源的El Tor和1株临床来源的O139组成,PFGE-D型由1株环境来源的El Tor组成,PFGE-E型由1株环境来源的O139组成,PFGE-F型由1株临床来源的O139组成。结论PFGE指纹图谱提示O139起源于不同克隆的El Tor霍乱弧菌,为了解O139的进化路线和流行规律提供了有效证据。作为高分辨率的基因分型工具,PFGE可用于追踪霍乱弧菌的暴发流行传染源,并在其分子流行病学研究中发挥重要作用。