脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景：人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞。 目的：体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞。 方法：无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理。倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记。诱导后：检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达。 结果与结论：传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44。诱导后von Kossa染色表现为阳性。碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P < 0.05),不同时间点比较21 d最高(P < 0.05)。RT-PCR显示：诱导组21,28d 碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P < 0.05)。诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达。提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞。     

腺病毒介导骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞

背景：已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族最具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少。 目的：探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2007-08/2008-06在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成。 材料：新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供。携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠。 方法：取兔颈后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞。取生长良好的第3代细胞,以1×108 L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪干细胞,并设立未转染对照组。 主要观察指标：细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜素红染色测定转染后成骨活性。 结果：转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节;未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成。与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长。脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12 h后即有荧光表达,转染3,6,9,12 d后人骨形态蛋白9 mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性。转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达。 结论：携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用。     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景：由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配，单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想，因此，应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度。 目的：观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用。 方法：全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞，分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞，设定感染复数值为5×104，观察两组细胞形态改变，分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定，比较两组成骨活性差异。 结果与结论：人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后，细胞形态呈现典型的成骨改变，碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变。绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变。人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P < 0.01)。提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。 目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。 方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体Lipofectamine™ 2000分别介导人骨形态发生蛋白2 基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。 结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为(18.0±0.42)%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

体外构建腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石的植骨材料

背景：随着组织工程和基因工程技术迅速发展,基因增强的组织工程骨为临床治疗骨缺损带来美好的前景。 目的：观察经腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2表达载体(Ad-BMP-2)转染后的兔骨髓间充质干细胞在纳米羟基磷灰石植骨材料上的黏附、增殖及骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：用Ad-BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞,免疫组化、蛋白印迹法检测转染后细胞内骨形态发生蛋白2的表达情况。将转染48 h的细胞均匀接种到纳米羟基磷灰石植骨材料上,扫描电镜观察细胞黏附状况,并采用MTT比色法测定骨髓间充质干细胞的增殖情况;消化收集黏附植骨材料上第3,5,7天的细胞,蛋白印迹检测黏附材料上细胞骨形态发生蛋白2的表达。 结果与结论：转染后,骨髓间充质干细胞内骨形态发生蛋白2有高表达;扫描电镜见转染细胞在纳米羟基磷灰石材料孔隙周围及孔隙内黏附生长良好并大量增殖,MTT分析结果显示,纳米羟基磷灰石对骨髓间充质干细胞的体外增殖无抑制作用,复合后骨形态发生蛋白2有较高表达。结果表明经Ad-BMP-2转染后的骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石植骨材料生物相容性好,细胞在材料上能稳定长效地分泌骨形态发生蛋白2。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达*◆

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。 目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。 方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。 结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比*

背景：利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一。 目的：观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和rAAV2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增殖能力的变化。 方法：脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部。机械消化和酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增。分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(rAAV2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达。rAAV2-EGFP转染后,需加入2 μL丁酸钠(1 mol/L)。采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响。 结果与结论：体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定。Ad5-EGFP组和rAAV2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%。腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高。腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平。     

骨形态发生蛋白2和音猬因子体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：研究表明，骨形态发生蛋白2和音猬因子联合诱导干细胞的定向分化存在理论上的可能性，但目前联合诱导间充质干细胞的方向纷繁复杂，且众说纷纭。 目的：观察骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外联合和单独应用促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。 设计、时间及地点：随机分组设计，对比观察，于2008-12在江苏大学临床医学院实验室完成。 材料：6周龄SPF级SD大鼠10只，体质量140~160 g，雌雄不拘，用于间充质干细胞的获得、培养和传代。重组人骨形态发生蛋白2、音猬因子为PeproTech公司产品。 方法：将SD大鼠的间充质干细胞分离培养后分为4组：重组人骨形态发生蛋白2组：加入100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2；音猬因子组：加入20 μg/L音猬因子；联合组：100 mg/L重组人骨形态发生蛋白2联合20 μg/L音猬因子作用于SD大鼠间充质干细胞；对照组：不加任何干预措施。 主要观察指标：倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化；MTT法检测细胞培养第3，6，9，12天细胞增殖数和细胞碱性磷酸酶活性；以及成骨细胞表型的检测和Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹分析，以比较各组诱导成骨能力的差异。 结果：①间充质干细胞培养24 h后部分贴壁，贴壁细胞呈圆形或椭圆形，第7天左右细胞铺满瓶底，多为梭形。条件培养基培养3 d后，联合组细胞由长梭形转变为多角形。随后重组人骨形态发生蛋白2组细胞发生成骨样改变，音猬因子组细胞未见明显形态学改变。②相同时间点联合组、重组人骨形态发生蛋白2组、音猬因子组细胞吸光度均高于对照组(P < 0.05)。联合组和重组人骨形态发生蛋白2组在各时间点碱性磷酸酶表达量均高于音猬因子组和对照组(P < 0.05)。③间充质干细胞经诱导培养7 d后，碱性磷酸酶细胞化学染色联合组和重组人骨形态发生蛋白2组呈阳性，联合组可见胞质中棕黄色颗粒，音猬因子组和对照组阴性。诱导培养14 d后，Ⅰ型胶原免疫荧光染色音猬因子组和对照组均为阴性，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性，但联合组细胞数量明显增多，细胞间融合较好，重组人骨形态发生蛋白2组细胞融合欠佳。矿化沉积茜素红染色音猬因子组和对照组仍为阴性，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组为阳性，联合组细胞间可见红色的钙结节。④蛋白免疫印迹分析显示，与对照组相比，联合组和重组人骨形态发生蛋白2组Ⅰ型胶原蛋白表达增加，联合组尤其明显，音猬因子组与之接近。 结论：骨形态发生蛋白2和音猬因子在体外能明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化并且具有明显的协同相关性。     

瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景：瘦素及其受体在中枢和外周多个部位均有表达,具有多种生物学功能,对于骨代谢有着重要的影响作用,但目前瘦素影响骨重建的机制尚未完全明了。 目的：探讨瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/2008-09在山西医科大学生化与分子生物学实验室完成。 材料：健康志愿者髂骨骨髓由山西医科大学第二医院提供。瘦素为Sigma公司产品。 方法：采用全骨髓法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代以1×108 L-1密度接种至预置盖玻片的6孔培养板中,设立3组：成骨诱导组添加原代培养液后,再加入含10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、50 mg/L维生素C的成骨诱导培养基;成骨+瘦素诱导组添加成骨诱导培养基后,再加入50 nmol/L瘦素;空白对照组仅加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面标志表达、钙化结节染色结果、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原及骨钙素含量、骨保护素和RANKL蛋白的表达。 结果：第3代骨髓间充质干细胞CD44和CD71阳性率分别为95.21%,72.31%,CD34阳性率仅为0.39%。成骨诱导21 d后von Kossa染色可见呈棕黑色的细胞外基质钙盐沉积。诱导14 d与空白对照组比较,成骨诱导组、成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原、骨钙素含量均明显升高(P < 0.05);且成骨+瘦素诱导组各指标升高幅度明显高于成骨诱导组(P < 0.05)。与成骨诱导组比较,成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞骨保护素蛋白的表达明显上调(P < 0.05),RANKL蛋白的表达明显下调(P < 0.05)。 结论：瘦素作用于人骨髓间充质干细胞后可促使其向成骨细胞分化,可能通过骨保护素/RANKL途径发挥对骨代谢的调节作用。     

辛伐他汀对幼鼠骨发育及骨髓基质干细胞成骨分化的影响

背景：辛伐他汀作为常用降脂类药物,表现出一定的促成骨分化和骨形成作用,但目前的研究结果尚有争论,尤其对幼鼠骨发育的影响并无报道。 目的：课题创新性设计观察辛伐他汀对幼鼠骨小梁骨形成相关因子表达以及骨髓基质干细胞成骨分化的影响。 方法：1周龄雄性SD大鼠20只,随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组皮下注射辛伐他汀[5 mg/(kg•d)]2周,对照组给与安慰剂2周。采用免疫组织化学方法检测胫骨上端骨小梁成骨相关因子骨形态发生蛋白2、基质金属蛋白酶13、血管内皮生长因子等因子的表达情况;取双侧股骨骨髓基质干细胞向成骨方向诱导培养。培养14 d分别进行碱性磷酸酶染色,21 d采用Real-time PCR法检测骨形态发生蛋白2、RUNX2、Osterix、MSX2、DLX3、DLX5等成骨过程中相关因子mRNA的表达,28 d进行von Kossa染色。 结果与结论：①实验组和对照组胫骨上端骨小梁骨形态发生蛋白2、基质金属蛋白酶13、血管内皮生长因子等因子的表达差异无显著性意义。②两组碱性磷酸酶染色阳性细胞(胞浆蓝黑色)比例均在30%左右,差异无显著性意义(P > 0.05)。③骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中相关因子骨形态发生蛋白2、RUNX2、Osterix、DLX3、DLX5、MSX2 mRNA表达水平差异无显著性意义。④von Kossa 染色可见大小不等染为棕黑色的钙化点,其大小和密度两组比较差异无显著性意义。结果表明,皮下注射辛伐他汀[5 mg/(kg•d)]2周不能显著影响幼鼠骨小梁骨形成相关因子表达以及骨髓基质干细胞成骨分化。     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景：肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。 目的：观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。 方法：培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%~60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。 结果与结论：病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109 pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADM mRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11 d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。     

骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白4/7基因转染对骨髓基质干细胞成骨活性差异的比较**☆

背景：有文献报道骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)异源二聚体比同源二聚体的活性高，目前国内外尚无BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体间诱导成骨活性比较的报道。 目的：观察不同基因BMP-4、BMP-4/7对骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨活性的差异，探讨融合基因BMP-4/7的生物学活性。 方法：经脂质体转染分离培养的兔BMSCs，G418筛选出稳定表达株，利用RT-PCR法证明目的基因在BMSCs中的表达情况；以BMP-4和BMP4/7融合基因修饰的AAV载体，转染兔BMSCs，MTT法检测不同基因转染细胞的增殖能力；以BMP-4单基因和BMP-4/7融合基因修饰的AAV载体转染兔BMSCs 7 d后，测定两组细胞内碱性磷酸酶及骨钙素水平，观察成骨活性的变化。 结果与结论：实验成功构建高滴度的分别携带BMP-4单基因、BMP-4/7融合基因的重组腺相关病毒载体AAV-BMP-4、AAV-BMP-4/7；RT-PCR结果证明目的基因能够在BMSCs中得到稳定表达。AAV-BMP-4及AAV-BMP-4/7载体转染效率分别为68.20%、72.18%；转染BMSCs后，细胞增殖能力均明显提高，BMP-4/7融合基因的细胞增殖能力活性高于BMP-4单基因。以BMP-4和BMP-4/7融合基因修饰的AAV转染细胞7 d后，细胞内碱性磷酸酶活性明显上调，骨钙素水平升高，成骨活性均增强；两种基因比较，BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因(P < 0.01)。提示BMP-4、BMP-4/7修饰的AAV载体转染效率高，对BMSCs均有成骨活性，其中BMP-4/7融合基因成骨活性强于BMP-4单基因。     

永生化人骨髓基质细胞的表面抗原及多向分化研究

目的研究本所转入人端粒酶逆转录酶基因的人骨髓基质细胞（hMSC—TERT细胞）的生物学特性。方法复苏hMSC—TERT细胞第30代，扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原；进行体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导，并分别进行油红O染色、碱性磷酸酶染色及von Kossa染色。结果hMSC—TERT细胞表面抗原检测CD34、CD5、CD44、CD106、CD166均为阴性；脂肪细胞定向诱导后油红O染色见胞浆内有红色脂肪颗粒，成骨细胞定向诱导后见胞浆内有碱性磷酸酶染色阳性黑褐色颗粒，von Kossa染色见有钙结节形成。结论hMSC—TERT细胞依然保留骨髓基质干细胞的自我更新特性及多向分化潜能。     

肝细胞生长因子基因转染脂肪细胞对移植组织工程脂肪存活的影响**★

背景：在脂肪组织工程的研究中，若将种子细胞与支架材料复合后移植，则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪。肝细胞生长因子可以促进血管生成、减少纤维组织增生。 目的：观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织工程脂肪移植存活的影响。 设计、时间及地点：随机区组设计的动物实验，于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院医学科学实验中心完成。 材料：纳入Wistar大鼠用于分离、培养骨髓间充质干细胞及植入细胞-支架复合物。 方法：①分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞，诱导成脂，携带绿色荧光蛋白基因及肝细胞生长因子基因的重组腺病毒毒株分别转染脂肪细胞，流式细胞仪测定转染效率，应用酶联免疫吸附试验法测定培养上清中肝细胞生长因子的表达，将脂肪细胞接种于聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架。②将75只Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为3组：脂肪细胞组、Ad-肝细胞生长因子转染组及Ad-绿色荧光蛋白转染组分别将脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染肝细胞生长因子基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染绿色荧光蛋白基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物移植于大鼠腿部肌肉之间。 主要观察指标：移植后3，7，14，28，60 d，每组各取5只大鼠麻醉后处死，取出移植物。电镜观察；并行苏木精-伊红、油红O、Masson’s染色，观察病理改变；同时用免疫组织化学法检测组织中肝细胞生长因子表达，观察并计数血管生成。 结果：①骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞胞浆内富含丰富的脂滴，重组腺病毒感染复数=100时，携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒株转染脂肪细胞效率可达64.39%。②移植3，7，14 d时，Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中肝细胞生长因子的表达高于其他组（P < 0.05），且3 d达到高峰。③移植3，7，14，28，60 d时，Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中血管生成高于其他组（P < 0.05），且7 d时血管增加的幅度最大。④移植28，60 d时，Ad-肝细胞生长因子转染组坏死程度均小于其他组，电镜下脂肪细胞也多于其他组。 结论：携带肝细胞生长因子基因的脂肪细胞在移植物中能够表达肝细胞生长因子，促进移植组织工程脂肪血管生成，进而促进移植组织的成活。     

诱导分化过程中不同融合状态大鼠骨髓间充质干细胞成骨的差异

背景：诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方案已基本成熟，但是诱导过程中影响分化效果的因素仍处于探索阶段。 目的：观察诱导时机的选择对大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的影响。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察实验，于2006-08/2007-01在苏州大学江苏省干细胞重点实验室完成,省级重点实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠，雌雄不限，体质量150~200 g。 方法：采用Percoll淋巴细胞分离液分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以5×107 L-1密度分组培养，诱导组分别于接种当时、细胞达50%~60%融合时、细胞达85%~95%融合时加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导培养基诱导。非诱导组采用普通培养基培养。 主要观察指标：诱导后7，14 ，21，28 d行钙钴染色、Von-Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测成骨细胞能力。定期在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长状况。 结果：经钙钴染色后，诱导组大部分染色的细胞呈阳性反应，胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细胞颗粒，大多数多角形细胞呈阳性，如铺路卵石样排列，随着时间的延长，可见片状强阳性细胞，以细胞达85%~95%融合时诱导培养组数量最多，结节体积最大。非诱导组未见片状强阳性细胞。Von-Kossa 染色后可见深棕色致密结节。以细胞达85%~95%融合时诱导培养组形成结节较早，同期相比数量较其他组多。细胞内碱性磷酸酶活性检测表明经成骨诱导剂诱导后与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高，表现细胞成骨分化特点。 结论：初始接种密度相同的情况下，细胞间相互接触程度越高，成骨能力越强。     

骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化*

背景：骨碎补促进骨损伤愈合疗效确切,但具体作用机制尚不清楚。 目的：观察骨碎补总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。 方法：冲洗兔股骨和胫骨骨髓腔获取骨髓,采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外纯化扩增兔骨髓间充质干细胞;以四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度骨碎总黄酮对兔骨髓间充质干细胞增殖的影响;经骨碎补总黄酮体外诱导后,行扫描电镜形态学观察,碱性磷酸酶染色、茜素红染色和Von Kossa银染色了解细胞钙化情况。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞可以通过密度梯度离心法联合贴壁培养法扩增和纯化;含骨碎补总黄酮血清培养后,四甲基偶氮唑蓝测定结果显示,骨碎补总黄酮浓度为10-6 mmol/L时可明显促进兔骨髓间充质干细胞增殖。经骨碎补总黄酮诱导液诱导,扫描电镜下可见成骨细胞样形态和钙结节形成;细胞碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色和Von Kossa银染色均呈阳性,提示骨碎补总黄酮可促进兔骨髓间充质干细胞增殖和分化。     

Dorsal root ganglion neurons promote proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Preliminary animal experiments have confirmed that sensory nerve fibers promote osteoblast differentiation, but motor nerve fibers have no promotion effect. Whether sensory neurons promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells remains unclear. No results at the cellular level have been reported. In this study, dorsal root ganglion neurons(sensory neurons) from Sprague-Dawley fetal rats were co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with green fluorescent protein 3 weeks after osteogenic differentiation in vitro, while osteoblasts derived from bone marrow mesenchymal stem cells served as the control group. The rat dorsal root ganglion neurons promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cell-derived osteoblasts at 3 and 5 days of co-culture, as observed by fluorescence microscopy. The levels of m RNAs for osteogenic differentiation-related factors(including alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin and bone morphogenetic protein 2) in the co-culture group were higher than those in the control group, as detected by real-time quantitative PCR. Our findings indicate that dorsal root ganglion neurons promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, which provides a theoretical basis for in vitro experiments aimed at constructing tissue-engineered bone.     

超极化激活环化核苷酸门控通道基因转染猪骨髓间充质干细胞

背景：研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN）电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用。 目的：观察HCN2基因重组腺病毒转染后猪骨髓间充质干细胞目的基因的表达及电生理特征。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外观察,于2007-07/2008-03在解放军第二军医大学胸心外科实验室完成。 材料：Yorkshire猪由解放军第二军医大学动物所提供,HCN2质粒由意大利Dario DiFrancesco教授惠赠,重组腺病毒Ad.HCN2由本实验室采用Ad5系统构建并保存。 方法：Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离纯化猪骨髓间充质干细胞,以感染复数=50进行Ad.HCN2转染,同时设立未转染组和转染Ad.Null组。 主要观察指标：通过RT-PCR、免疫荧光染色检测各组细胞HCN2 mRNA和蛋白的表达,用全细胞膜片钳检测各组细胞电生理学变化。 结果：未转染组和转染Ad.Null组均未见扩增片段,而Ad.HCN2扩增后在250~500 bp可见扩增片段,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同。转染后细胞核染色强度明显弱于胞膜和胞浆,与HCN2蛋白的分布相符合,未转染组及转染Ad.Null组无HCN2蛋白阳性表达。全细胞膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位-140 mV,呈电压依赖性,当给予4 mmol/L CsCl后,内向的起搏电流即被明显抑制;未转染组及转染Ad.Null组细胞均无起搏电流。 结论：通过起搏基因HCN2重组腺病毒载体可成功转染猪骨髓间充质干细胞,使其能够表达HCN2通道蛋白,全细胞膜片钳可检测到起搏电流。