人Persephin基因重组腺病毒载体构建及在C17．2神经干细胞的表达

目的:Persephin是近年来发现的对多巴胺神经元的发育与分化起调控作用重要基因,单纯神经干细胞系C17.2移植治疗帕金森病在体内分化为多巴胺能神经元比例不高。实验构建了人Persephin基因重组腺病毒载体,并观察其在C17.2神经干细胞的表达。方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成(广东省重点实验室)。①实验材料:流产胚胎由中山大学附属第二医院妇产科提供,产妇及其家属均签署知情同意书。病毒骨架质粒载体pAdEasy-1、穿梭载体PAdTrack-CMV(含绿色荧光蛋白基因)、大肠杆菌菌株BJ5183和DH5α、人胚肾293细胞均为本室保存。C17.2神经干细胞由美国哈佛大学医学院Snyder教授惠赠。②实验方法:采用反转录聚合酶链式反应从人胚胎脑获得PersephincDNA。将重组质粒pAdTrack-CMV-Persephin与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVPersephin,转化体外培养的C17.2神经干细胞。③实验评估:用原位杂交、免疫组化、Westernblot法检测Persephin在C17.2神经干细胞中的表达。结果:①人Persephin基因的克隆与测序分析:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,其Persephin基因片段长约310bp,与预期分子量相符。Persephin基因被克隆于载体pMD18-T,以SaiⅠ和XhoⅠ双酶切可回收长约310bp的克隆片段,测序结果证实所克隆的为人PersephincDNA。②大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组及鉴定:Persephin重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-Persephin用PacⅠ酶切可切出4.1kb的目标片断,PCR鉴定可从重组腺病毒质粒中可扩增出PersephincDNA片断(310bp)。病毒滴度在脂质体转染后为1.9×107pfu/L。用收集的上清4次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度经绿色荧光蛋白检测达3.0×1011pfu/L。③Persephin基因在C17.2神经干细胞中的表达:免疫组化与原位杂交显示转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞胞浆中有Persephin蛋白和mRNA表达。提取感染病毒的C17.2神经干细胞的总蛋白,经Westernblot检测可见一特异性蛋白条带存在。结论:采用RT-PCR法成功克隆人PersephincDNA并构建其腺病毒载体,获得了稳定表达Persephin的神经干细胞克隆,为进一步分析转基因神经干细胞治疗神经退行性疾病提供可行的操作方法。     

人血管内皮生长因子165基因转染对C17.2神经干细胞体外增殖分化的影响

目的:构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体,并观察其对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响.方法:将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165,转染体外培养的C17.2神经干细胞.以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组.通过酶联免疫吸附测定检测其在C17.2神经干细胞中不同时间段的表达.C17.2神经干细胞培养24 h后,将pAdCMV GFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组),24,48,72 h后每孔加入四氮唑盐10μL,检测pAdCMV转染对C17.2神经干细胞增殖的影响.将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白,pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞设为对照2组.收集C17.2神经干细胞(C17.2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞组),对两组细胞进行培养,将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定,行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测.结果:①重组腺病毒AdCMV血管内皮生长因子165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/L.酶联免疫吸附检测转染pAd血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞上清VEGF浓度显示转染后第3天为(710±82)ng/L,明显高于转染前(118±20)ng/L,第5天和第7天血管内皮生长因子165达分泌高峰,分别为(1110±126),(1135±138)ng/L,此后渐下降,于第13天(355±35)ng/L仍显著高于对照1组(¨0±22)ng/L和转染前(t=5.87,P＜0.01).②C17.2神经干细胞培养24,48,72 h后对照2组干细胞增殖率分别为(0.1367 ±0.018 6)%,(0.330 0±0.013 4)%,(0.660 3±0.020 7)%,pAdCMV绿色荧光蛋白转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.139 9±0.018 3)%,(0.373 0±0.013 6)%,(0.671 3±0.233)%;pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.146 9±0.0171)%,(0.363 1 ±0.013 6)%,(0.635 3±0.024 7)%.两个实验组神经干细胞增殖率与对照组1组比较,P＞0.05.pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞增殖率与pAdCMV绿色荧光蛋白转染组比较,P＞0.05).③C17.2神经干细胞组和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞组的巢蛋白阳性细胞率分别为(15.72±1.003)%,(17.63±1.082)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率分别为(17.63±1.082)%,(21.49±1.022)%,两组比较无明显差异(P＞0.05).结论:成功构建pAdCMV血管内皮生长因子165重组腺病毒,获得了稳定表达血管内皮生长因子165的神经干细胞克隆,体外pAdCMV血管内皮生长因子165未对C17.2神经干细胞增殖和分化产生影响.     

人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体构建及其在C17.2神经干细胞的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子腺病毒表达载体,并观察其在C17.2神经干细胞的表达。方法:实验于2004-03/11在中山大学附属第二医院林百欣医学中心完成。将胰岛素样生长因子克隆入复制缺陷性腺病毒穿梭质粒得到含胰岛素样生长因子的腺病毒穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组得到含胰岛素样生长因子的整合质粒,在HEK293A细胞中包装加膜,聚合酶链反应鉴定,大量扩增病毒。将含目的基因的病毒转染C17.2神经干细胞,原位杂交检测胰岛素样生长因子mRNA,蛋白印迹检测胰岛素样生长因子蛋白的表达,酶联免疫吸附实验检测胰岛素样生长因子蛋白的表达曲线。结果:经酶切鉴定及聚合酶链反应鉴定证实腺病毒载体构建正确。原位杂交检测到胰岛素样生长因子mRNA,蛋白印迹分析检测到胰岛素样生长因子蛋白在转染了重组腺病毒的C17.2神经干细胞内表达。酶联免疫吸附实验结果显示胰岛素样生长因子蛋白在病毒转染5～7d达高峰,13d仍高于转染前。结论:成功构建了含胰岛素样生长因子的重组腺病毒载体,转染了该腺病毒的C17.2神经干细胞可稳定表达胰岛素样生长因子。     

人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达

目的构建HSP75基因重组腺病毒载体,观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域,构建重组穿梭质粒p HBAd-MCM-HSP75-GFP,在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒p HBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,整合包装成重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定,HSP75基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒;重组腺病毒滴度为1.0×1010PFU/ml;Western blotting检测,转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建,对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。     

肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力

背景:基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少.目的:观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响.方法:贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞.用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率.骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组.在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果与结论:重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%.缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05).缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05).提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关.     

含NURR1基因腺病毒修饰神经干细胞移植治疗帕金森病的试验

目的:观察含NURR1基因腺病毒修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对帕金森病模型症状和组织学的改善。方法:实验于2004-03/2005-01在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。6-羟基多巴脑内立体定向及单侧纹状体两点定位注射制作SD大鼠帕金森病模型,1周后,行阿朴吗啡行为学检测,即阿朴吗啡(0.5mg/kg)腹腔内注射后30min内,计数大鼠平均每分钟身体旋转360°的次数,达到6圈/min及以上者为合格帕金森病模型,每周测1次,连续4周,获取稳定动物模型共31只,分为帕金森病模型对照组10只、帕金森病 C17.2组11只、帕金森病 C17.2 腺病毒组10只,无菌收集所需的C17.2神经干细胞、含NURR1基因腺病毒载体修饰C17.2神经干细胞,浓度为(1.0～4.0)×109L-1细胞,对入组的帕金森病模型进行无菌细胞注射移植,注射点与造模时注射点相同,每点约3μL,帕金森病模型对照组注射生理盐水。细胞移植后10d和4周进行阿朴吗啡诱发的帕金森病模型旋转试验,免疫组化检测帕金森病模型纹状体内酪氨酸羟化酶阳性神经元数量。结果:在实验过程中又有4只死亡,共有27只帕金森病模型鼠进入试验。①帕金森病模型旋转圈数:移植后10d和4周帕金森病 C17.2组和帕金森病 C17.2 腺病毒组均少于帕金森病模型对照组,帕金森病 C17.2 腺病毒组少于帕金森病 C17.2组(移植后10d:帕金森病模型对照组21.57±5.26,帕金森病 C17.2组3.90±0.90,帕金森病 C17.2 腺病毒组1.56±0.58;移植后4周:帕金森病模型对照组18.40±5.84,帕金森病 C17.2组3.60±0.67,帕金森病 C17.2 腺病毒组1.00±0.55,P<0.05)。②纹状体内酪氨酸羟化酶阳性细胞数:移植后10d帕金森病 C17.2组和帕金森病 C17.2 腺病毒组多于帕金森病模型对照组,帕金森病 C17.2 腺病毒组多于帕金森病 C17.2组(帕金森病模型对照组3.50±0.67,帕金森病 C17.2组13.17±1.89,帕金森病 C17.2 腺病毒组20.50±1.67,P<0.05)。结论:NURR1基因结合神经干细胞有效改善了帕金森病模型症状,提高移植后酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞的数量。     

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞

背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常.神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体.目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达.设计:细胞-基因学观察.材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠.方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液.取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCI中制备JetPEI/DNA复合体.用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×10~8L~(-1),向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL、JetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO_2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞.主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达.结果:转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%.各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平最高.结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达.     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡模型构建的研究

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与胃癌细胞株共同孵育一定时间后,观察细胞形态变化,观察细胞DNA含量的分布,测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,在形态学上表现为细胞膜起泡,染色质固缩,核碎裂,凋亡及小体形成;电泳呈凋亡特征性Ladder带;流式细胞仪分析显示,在D1期前出现亚2倍体凋亡峰;端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡取脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡,抑制端粒酶活性,抑制端粒合成,从而抑制胃癌细胞的生长。     

脑溢安对大鼠缺氧神经干细胞保护作用

目的:观察脑溢安对大鼠神经干细胞缺氧损伤后天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(activatedcysteinylaspartatespecificprotease-3,Caspase-3)活化及细胞凋亡的影响,探讨该药抗脑损伤的作用机制。方法:用分离、培养的神经干细胞(neuralstemcellsNSC)造成缺氧模型,以正常大鼠血清、含脑溢安的大鼠血清对缺氧后的神经干细胞进行干预,用脑溢安血清、正常血清、无血清干预缺氧的神经干细胞,以及未受缺氧损伤的正常神经干细胞进行实验,检测神经干细胞缺氧损伤后Caspase-3的活化情况并用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法犤terminal(TdT)-mediateddUTP-biotinnickendlabeling,TUNEL犦检测细胞凋亡情况。结果:正常血清缺氧神经干细胞组、无血清缺氧神经干细胞组有较多TUNEL阳性细胞,脑溢安血清缺氧神经干细胞组TUNEL阳性细胞数较少,而未缺氧的神经干细胞没有表达,脑溢安血清缺氧神经干细胞组与正常血清缺氧神经干细胞组、无血清缺氧神经干细胞组比较TUNEL细胞阳性细胞减少,差异有显著性意义(t=6.5826,6.6245,P<0.05)。脑溢安血清缺氧神经干细胞组与正常血清缺氧神经干细胞组及无血清缺氧神经干细胞组比较活化Caspase-3光密度比值减少,差异有显著性意义(t=4.2653,5.0131,P<0.05)。无血清、正常血清缺     

共转染EGFP和hMnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力的影响

目的:人正义、反义MnSOD基因和EGFP共转染恒河猴骨髓源神经干细胞,观察MnSOD基因对猴骨髓源神经干细胞抗氧化能力和报告基因表达的影响。方法:应用NucleofectorTM核转染仪将人正义、反义MnSOD基因和荧光真核表达载体共转染体外培养的恒河猴骨髓源神经干细胞,荧光显微镜下观察荧光蛋白在细胞内的表达,并检测转染细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:①转染24h后,共转染细胞可见荧光蛋白在骨髓源神经干细胞内有效表达,荧光显微镜下发强绿色荧光,其转染率约为80%。②转染人正义MnSOD基因的细胞的总SOD活性犤(8.03±0.74)NU/mg犦与转染人反义MnSOD基因细胞的总SOD活性犤7.19±0.86)NU/mg犦差异无显著性意义,但MnSOD活性前者明显高于后者1.89倍。结论:MnSOD基因与EGFP基因共转染骨髓源神经干细胞,均有效表达,提高了细胞内MnSOD活性,为多基因联合治疗帕金森病提供了可行的技术平台。     

血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸抑制脑动静脉畸形血管内皮细胞的增殖

背景:采取反义基因治疗技术控制血管内皮细胞生长因子基因表达,遏止血管生成,是脑血管外科中治疗人脑动静脉畸形的崭新课题。目的:观察血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸对人脑动静脉畸形血管内皮细胞增殖的抑制作用。设计:观察对比实验。单位:解放军沈阳军区总医院神经外科。材料:实验于2006-08/2006-12在解放军沈阳军区总医院的全军神经医学研究所完成。收集2006年解放军沈阳军区总医院神经外科18例脑动静脉畸形患者手术切除的完整人脑动静脉畸形新鲜标本。男12例,女6例;平均40岁。脑动静脉畸形按Spetzler分级:Ⅱ级10例,Ⅲ级8例。全部病例术前均经全脑血管造影证实。人脑动静脉畸形标本获取术前经患者或其家属知情并签同意书。内皮细胞生长添加剂(ECGS;美国Sigma),391型DNA自动合成仪(上海生工利用美国PE公司),厌氧培养箱(浙江产DY-1型),人血管内皮细胞生长因子酶联检测试剂盒购于北京TBD公司,进口分装,96E酶标仪(ERMA,INC)。细胞周期分析试剂盒(BD公司),流式细胞仪(FACSCalibur,BD公司)。方法:①实验过程:采用组织块贴壁法培养人脑动静脉畸形血管内皮细胞,实验用传至3代细胞,随机分成反义组、正义组和对照组,每组4瓶细胞。反义组、正义组分别采用人工合成血管内皮细胞生长因子正义、反义硫代脱氧寡核苷酸,经阳性脂质体包裹后转染体外培养的人脑动静脉畸形血管内皮细胞,对照组不予处理,将各组细胞置于37℃、体积分数0.95N2、0.05CO2厌氧培养箱分别孵育2,4和8h。②实验评估:测定细胞周期。测定细胞血管内皮细胞生长因子蛋白含量。检测细胞血管内皮细胞生长因子mRNA表达。主要观察指标:各组细胞缺氧不同时间点血管内皮细胞生长因子mRNA和蛋白表达及细胞增殖指数。结果:①血管内皮细胞生长因子mRNA表达:对照组细胞缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子mRNA水平高于缺氧前(P<0.05),反义组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子mRNA水平低于对照组(P<0.05)。②血管内皮细胞生长因子蛋白含量:对照组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子蛋白含量高于缺氧前(P<0.05),反义组缺氧2,4,8h后血管内皮细胞生长因子蛋白低于对照组(P<0.05)。③细胞增殖指数:对照组人脑动静脉畸形内皮细胞缺氧4,8h后细胞增殖指数(P<0.05)。反义组缺氧4,8h后低于对照组(P<0.05)。结论:缺氧可能在基因转录水平诱导血管内皮细胞生长因子表达,反义血管内皮细胞生长因子能够显著抑制缺氧诱导的人脑动静脉畸形内皮细胞血管内皮细胞生长因子基因表达和细胞增殖。     

流体切应力对脑动静脉畸形内皮细胞增殖与c-myc表达的影响

背景:切应力可以直接介导内皮细胞表达一些编码与血管生成相关的细胞因子基因,血液的流体切应力对调节血管结构和功能具有重要的生物学作用。目的:观察流体层流切应力对人脑动静脉畸形血管内皮细胞增殖与原癌基因c-myc表达的影响。设计:随机对照的技术方法。单位:解放军沈阳军区总医院神经外科。对象:实验于2006-11/2007-02在解放军沈阳军区总医院全军神经医学研究所完成。选用2006解放军沈阳军区总医院神经外科SpetzlerⅡ-Ⅲ级20例脑动静脉畸形患者手术切除的人脑动静脉畸形新鲜标本,全部病例术前均经全脑血管造影证实。M199培养液(Gi1bco BRL),优质胎牛血清(HyClone),内皮细胞生长添加剂(ECGS;美国Sigma),CO2培养箱(美国Forma Scientific),细胞周期分析试剂盒(BD公司),流式细胞仪(FACS Calibur,BD公司),鼠抗人c-myc单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),RT-PCR试剂盒(Promega)。方法:采用组织块贴壁法培养人脑动静脉畸形血管内皮细胞,按所受切应力大小将细胞分为4组:对照组、低切组、中切组和高切组。将培养的人脑动静脉畸形内皮细胞单层置于平板流动系统内,低切组、中切组和高切组细胞分别经低、中、高切应力作用8h,对照组切应力为0Pa。应用流式细胞术测定细胞增殖指数。检测c-myc蛋白表达。检测c-mycmRNA表达。主要观察指标:不同切应力作用下内皮细胞c-myc蛋白及mRNA表达和细胞增殖指数。结果:①细胞增殖指数:中切组和高切组内皮细胞增殖指数高于对照组(P<0.05,0.01)。②c-myc蛋白表达:c-myc免疫阳性表达随切应力增高而递增,各切应力组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05～0.01)。③c-mycmRNA表达:低切组和中切组内皮细胞增殖指数高于对照组(P<0.05)。结论:流体层流切应力能够在基因转录水平诱导c-myc表达,并可能通过激活c-myc基因表达而促进人脑动静脉畸形血管内皮细胞增殖。     

含NURR1基因重组腺病毒旁分泌对神经干细胞分化的影响

目的:探讨含NURR1基因的腺病毒(Ad-NURR1)旁分泌效应对C17.2神经干细胞分化的影响。方法:用Western blot检测Ad-NURR1 nurr1蛋白分泌,以旁分泌试验检测nurr1蛋白对神经干细胞分化的影响。结果:Western blot证实Ad-NURR1表达的nurr1蛋白可分泌到细胞外上清内,并可明显促进神经干细胞向神经元方向分化。结论:nurr1蛋白可分泌到细胞外并能促进神经干细胞分化。     

腺病毒介导的热休克蛋白70在神经元和胶质细胞中的抗缺氧研究

目的 探讨重组腺病毒介导的热休克蛋白70(HSP70)表达对神经元和胶质细胞缺氧/再复氧损伤的保护作用.方法 制备携带全长HSP70基因的重组腺病毒vAd-HSP70.感染体外培养的神经元和胶质细胞,检测靶细胞中外源性HSP70的表达.感染vAd-HSP70 24、48、72 h组和感染vAd-GFP对照组的细胞经缺氧/再复氧处理后,分别测定细胞活性、细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性及线粒体和胞质内细胞色素C含量.结果 感染vAd-HSP70的神经细胞可检测到外源性HSP70基因表达.经缺氧/再复氧处理,感染vAd-HSP70组细胞活性较感染vAd-GFP对照组明显增强(P均＜0.05);感染vAd-HSP70 24、48、72 h组细胞培养上清液中LDH活性[(1 480±121)、(1 023士106)、(1 132±197)U/L]均明显低于感染vAd-GFP对照组[(1 976±190)U/L],线粒体中细胞色素C含量(0.986±0.012、1.028±0.007、1.014±0.008)均明显高于感染vAd-GFP对照组(0.970±0.003),而胞质中的细胞色素C含量(0.987±0.008、0.960±0.005、0.964±0.003)则低于感染vAd-GFP对照组(1.011±0.005,P＜0.05或P＜0.01),其中以感染48 h最为理想(P均＜0.01).结论 腺病毒介导的外源性HSP70表达可保护神经元和胶质细胞抵抗缺氧/再复氧损伤,具有明确的细胞保护作用.     

大鼠不同纯度胰岛样本中干细胞标志物细胞角蛋白19的表达

背景:胰腺中存在的干细胞在合适的培养条件下可分化为具有内分泌功能的细胞,可以作为一种新的胰岛来源治疗糖尿病。目的:分析大鼠胰岛纯化程度与其中所携带的干细胞数量的关系。设计:以细胞为观察对象,对比实验。单位:绵阳市第三人民医院材料:实验于2005-03/2006-03在重庆医科大学附属一院中心实验室完成。选取30只清洁级健康雄性SD大鼠,鼠龄50 d。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。细胞角蛋白19和β-actin引物由上海英俊生物有限公司设计。Brdu试剂、小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体、兔抗鼠CK-19多克隆抗体、Brdu免疫组织化学试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。Histostain~(TM)-DS免疫组织化学双染试剂盒购于北京中杉公司。方法:大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记,均采用胶原酶V型通过胰管对胰腺进行灌注,切取胰腺,剪碎,吹打、消化、离心获得胰岛细胞沉淀物。离心后沉淀物进行如下处理:即,不纯化组:胰岛沉淀物不进行纯化;高密度介质纯化法组:胰岛沉淀物中加入体积分数为25%的Ficoll液纯化;两种不同密度梯度纯化法组:胰岛沉淀物依次加入25%及11%的Ficoll液纯化。主要观察指标:应用免疫组织化学法检测胰岛样本中Brdu及细胞角蛋白19阳性细胞的表达,应用反转录聚合酶链反应检测不同纯度胰岛中细胞角蛋白19 mRNA的表达。结果:①胰岛纯度:不纯化组最低,3组获得的胰岛细胞纯度比较,差异有显著性意义(F=89.42,P<0.05)。②胰岛样本中Brdu和细胞角蛋白19阳性细胞的表达:不纯化组的阳性表达高于高密度介质纯化法组和两种不同密度梯度纯化法组,差异有显著性意义(F=18.64,22.12,38.61,P<0.01)。③胰岛中细胞角蛋白19 mRNA的表达:不纯化组最强,两种不同密度梯度纯化法组最弱。结论:不同纯度的胰岛中有Brdu及细胞角蛋白19阳性细胞,在低纯度胰岛中含有较多的干细胞。     

β-arrestin 2抗基因RNA对小鼠C17.2神经干细胞μ阿片受体脱敏感化的影响

背景:前期实验中采用新型基因沉默方法--抗基因RNA下调了细胞内β-arrestin 2基因的表达,实现细胞水平的基因敲除效应.目的:在前期实验基础上,观察抗基因RNA下调小鼠C17.2神经干细胞β-arrestin 2基因表达后其对DAMGO诱导μ阿片受体脱敏感化的影响.方法:小鼠C17.2神经干细胞应用含体积分数为10%胎牛血清、10 mg/L青霉素和10 mg/L氨苄青霉素的DMEM培养基,置于37 ℃,体积分数为5% CO_2培养箱进行培养.待细胞长至80%汇合,用0.25%胰蛋白酶消化传代,每五六天传代1次.通过RT-PCR和免疫细胞化学法检测C17.2细胞μ阿片受体的表达.在脂质体介导下,将已被证实具有基因沉默效应的抗基因RNA片段转染C17.2细胞,荧光显微镜下观察转染24 h后绿色荧光蛋白的表达.应用μ阿片受体选择性激动剂DAMGO和[~(35)S]GTPγS结合实验检测C17.2细胞μ阿片受体与G蛋白的耦联能力.结果与结论:RT-PCR结果证实C17.2细胞内有μ阿片受体存在,而免疫细胞化学结果显示μ阿片受体主要在细胞膜和细胞浆中表达.荧光显微镜下观察可见转染质粒pGPU6/GFP/Arrb9的C17.2细胞中有绿色荧光蛋白的表达.[~(35)S]GTPγS结合实验结果显示:未应用DAMGO进行处理的细胞中,[~(35)S]GTPγS结合的刺激比率为(253±17)%;应用DAMGO预先对细胞进行处理后,刺激比率降为(113±14)%(P < 0.05);而转染β-arrestin 2抗基因RNA的细胞在DAMGO刺激下,[~(35)S]GTPγS结合的刺激比率则仍维持在(239±15)%,表明抗基因RNA下调β-arrestin 2的表达,可抑制μ阿片受体脱敏感的产生.     

不同胎龄大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的比较

背景:胚胎来源干细胞的分化潜能不仅受到诱导条件影响,也受来源胚胎胚龄的影响.目的:实验拟观察不同胎龄大鼠中脑神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化能力.设计:随机对照观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-03/2007-09在中山大学附属第一医院实验室完成.成年孕SD大鼠30只,体质量350～400 g,由中山大学动物实验中心提供.许可证号码为SCXK(粤)2007-0034.实验过程中对动物处置符合动温桌硌П曜?DMEM/F12无血清培养液、B27添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为0.1的胎牛血清为英国Gibco公司产晶;白细胞介素1α,白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子购自美国R&D公司:白血病抑制因子购自英国PEPROTECH公司:酪氨酸羟化酶抗体购自美国Santa Cruz公司;巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体及胶质纤维酸性蛋白抗体为美国CHEMICON公司产品.方法:①分别于大鼠孕10,12,14,16,18天摸球法随机选取6只,麻醉后处死孕鼠,无菌条件下剖腹取胚胎,分离中脑腹侧脑组织进行神经干细胞培养.在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中分别培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞,经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.②诱导分化6 d后观察分化细胞生长情况并进行免疫细胞化学鉴定:酪氨酸羟化酶染色标记后通过流式细胞仪检测分化的多巴胺能神经元比率.主要观察指标:①不同胎龄大鼠神经干细胞诱导分化后生长情况及免疫细胞化学鉴定结果.②神经干细胞诱导分化后酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率.结果:①孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞球在诱导分化液中贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向外呈放射状生长,分化6天的细胞多数有1～2个长突起或有多个短突起.神经球经巢蛋白免疫细胞化学染色,大部分细胞胞浆染色呈阳性.②孕10,12,14,16,18 d胚胎大鼠中脑神经干细胞在诱导分化液中培养6 d后.流式细胞仪检测其诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比率分别为(10.3±2.5)%,(21.6±3.4)%,(16.7±2.8)%,(14.2±3.2)%,(8.9±1.8)%,各组间比较差异均有显著性意义(P<0.05),其中孕12 d大鼠中脑神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.结论:不同胎龄大鼠中脑的神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的能力不同,以孕12 d诱导分化成多巴胺能神经元比例最高.     

甲泼尼龙抑制神经干细胞并诱导其凋亡的研究

目的：研究甲泼尼龙对体外培养的神经干细胞的直接作用，为有效的结合这两种治疗方法提供依据和指导。方法：体外培养神经干细胞，加入MP培养12h、24h和48h后，用细胞活性检测试剂CCK-8，检测其对神经干细胞活性的影响，用Hoeehst 33258染色观察细胞凋亡，用Annexin V／PI双染色法检测神经干细胞凋亡比率。结果：甲泼尼龙对体外培养的活性有抑制作用，而且可以诱导体外培养的神经干细胞的发生凋亡。结论：甲泼尼龙不利于神经干细胞的生长，不宜在进行甲泼尼龙冲击疗法的同时进行神经干细胞移植。     

大鼠脑缺血损伤后骨髓间充质干细胞移植抑制Bcl-2及Bax介导的神经元凋亡

背景:骨髓间充质干细胞移植技术对脑损伤修复具有重要的意义,但其作用途径尚需讨论。目的:观察脑缺血模型大鼠移植骨髓间充质干细胞后,皮质及海马区Bcl-2和Bax的表达变化,分析骨髓间充质干细胞颅内的移植抑制神经元凋亡的作用机制。设计:随机对照实验。单位:青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所。材料:选用雄性成年Wistar大鼠24只,体质量180～240g,由山东大学实验动物中心提供实验大鼠随机分为对照组、损伤组、损伤移植组,每组8只。溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU,Sigma公司);TUNEL试剂盒,Bcl-2,Bax抗体试剂盒购自北京中山生物工程公司。方法:实验于2005-04/2006-09在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。损伤组和移植组大鼠采用颈外动脉线栓法建立脑缺血模型,移植组大鼠造模成功7d后在脑皮质和纹状体区注射浓度为2×10~(12)L~(-1)的原代体外培养的骨髓间充质干细胞悬液。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。主要观察指标:分别于造摸成功后7和14d进行TUNEL染色及免疫组织化学检测大脑皮质、海马区神经元凋亡和Bcl-2,Bax表达的变化。结果:①神经元凋亡情况:造模成功后7d,对照组来发现凋亡细胞,移植组凋亡细胞的数量少于损伤组,差异有非常显著性意义(P<0.01)。②Bcl-2和Bax表达:造模成功后14d,损伤组大鼠皮质和海马区Bcl-2阳性神经元的表达低于对照组和移植组,差异有非常显著性意义(P<0.01)。损伤组大鼠皮质和海马区Bax阳性神经元的表达高于对照组和移植组,差异有非常显著性意义(P<0 01)。结论:大鼠脑缺血后,骨髓间充质干细胞能够促进Bcl-2表达并抑制Bax表达,从而减少神经元凋亡。     

磁性三氧化二铁纳米粒子对小鼠腹腔巨噬细胞的氧化损伤作用

背景:已有报道表明纳米级的Fe2O3产生的细胞毒性与细胞的脂质过氧化存在一定的联系。氧化铁纳米粒子是否对巨噬细胞产生毒性,其毒性机制与氧化作用有何关联?目的:观察不同浓度Fe2O3纳米粒子对巨噬细胞的氧化损伤作用。设计:观察对比实验。单位:东南大学公共卫生学院。材料:RAW264.7细胞为小鼠腹腔巨噬细胞,购自中国科学院上海细胞所。Fe2O3纳米粒子(30nm)悬浮液由东南大学生物医学工程系制备提供。实验前先进行预处理:将Fe2O3纳米粒子悬浮液置60℃水浴中10h,然后37℃水浴过夜。如此反复3次,灭菌处理。小瓶分装,4℃保存。DMEM高糖培养液(美国Gibco公司);胰蛋白酶(美国Difco公司,进口分装);新生牛血清(杭州四季青公司);过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子自由基、乳酸脱氢酶、超微量ATP酶和考马斯亮蓝蛋白含量测定试剂盒(南京建成生物技术公司)。方法:实验于2006-03/07在东南大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系实验室完成。RAW264.7细胞用DMEM培养基于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。每日用倒置显微镜观察细胞生长情况,取生长状态良好的对数生长期细胞进行试验。①细胞中氧自由基的检测:将密度为1.5×105L-1的巨噬细胞接种于24孔培养板,每孔1mL,37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养24h后,以质量浓度为1.0700、0.5350和0.2675g/L的Fe2O3纳米粒子(30nm)悬浮液染毒细胞为纳米粒子干预组,并设生理盐水为溶剂对照组,24h后终止培养,染毒结束后,低温条件下用玻璃匀浆器破碎细胞,按试剂盒说明,分别测定细胞中过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子自由基。②培养液中乳酸脱氢酶活性及膜ATP酶活性的测定:纳米粒子干预组及对照组干预方法同上,染毒结束后,检测培养液中乳酸脱氢酶活性及膜ATP酶活性,乳酸脱氢酶活性的检测采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒,严格按照说明书进行操作。膜ATP酶活性的检测采用低温条件下用玻璃匀浆器破碎细胞,按试剂盒说明检测膜Na -K -ATP酶和Ca2 -Mg2 -ATP酶活性。主要观察指标:①不同质量浓度Fe2O3纳米粒子对细胞过氧化氢、羟自由基和超氧阴离子的影响。②乳酸脱氢酶活性、膜Na -K -ATP酶和Ca2 -Mg2 -ATP酶活性检测结果。结果:①Fe2O30.2675,0.5350,1.0700g/L纳米粒子干预组羟自由基水平高于溶剂对照组[(0.605±0.066),(0.410±0.080),(0.764±0.051),(0.285±0.057)mkat/g,P<0.05],超氧阴离子自由基高于溶剂对照组[(9.935±1.159),(8.912±0.131),(13.479±0.752),(5.635±0.475)μkat/g,P<0.05],Fe2O31.0700g/L过氧化氢水平高于溶剂对照组[(14.695±2.815),(2.397±0.399)mmol/L,P<0.05]②Fe2O3纳米粒子在实验浓度范围内,能够引起培养液中乳酸脱氢酶活性显著升高(P<0.05)。Fe2O3纳米粒子对细胞膜Na -K -ATP酶和Ca2 -Mg2 -ATP酶活性均产生影响,且随着Fe2O3纳米粒子染毒剂量增加,Na -K -ATP酶和Ca2 -Mg2 -ATP酶活性逐渐降低,与对照组比较,差异均具有显著性(P<0.05)。结论:Fe2O3纳米粒子剂量增加导致细胞内过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子自由基增多,从而使细胞膜通透性增加,膜Na -K -ATP酶和Ca2 -Mg2 -ATP酶活性受到抑制。