聚合酶链反应检测肿瘤组织的端粒酶活性

目的：比较聚合酶链反应－微孔板杂交法（PCR－MPH）和聚合酶链反应－聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PCR－PAGE）检测肿瘤组织端粒酶活性的临床价值。方法：PCR－MPH以地高辛标记端粒重复片段特异的探讨与PCR变性产物杂交,经酶底物显色,通过测定吸光度判断结果;PCR－PAGE方法直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离PCR扩增端粒酶的合成产物,经银染色,分析端粒酶活性。结果：PCR－MPH方法能准确、特异地检测出肿瘤组织的端粒酶活性,其灵敏度比PCR－PAGE法高100倍,结论：两种方法均可用于临床检测,只是PCR－MPH方法更简单、便一些。     

免疫-PCR法检测柯萨奇病毒B组抗原的实验研究

目的：建立免疫－PCR法,对分离培养和柯萨奇B组病毒（CoxB)毒株及临床可疑为CoxB感染的血清标本进行检测。方法：以间日疟原虫SSUrRNA基因为指示分子,采用生物系进行末端标记,利用酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR原理,建立免疫－PCR法,并对60份临床标本进行检测。结果：该方法具有较高敏感性和特异性,其敏感性是ELISA法的3000倍,也高出RT－PCR法10倍。结论：免疫－PCR法是检测CoxB抗原的敏感而特异的方法,为CoxB的临床早期快速鉴定和流行病学研究等提供了一种新的微量抗原检测手段。     

套式RT—PCR在丙型肝炎诊断中的应用

目的：探讨逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）在丙型肝炎诊断中的应用。方法：应用套式RT－PCR检测肝炎病人血清中HCVRNA,并同时用固相放射免疫法（RLA）检测病人血清中抗HCVRNA抗体。结果：193份肝炎病人血清中11．9％（23／193）可检出HCVRNA,10．9％（21／193）可检出抗HCVRNA抗体,两种检测结果相符率达98．4％,结论：套式RT－PCR对诊断丙型肝炎快速、特异性高,同时该检测法可避免放射性损伤和污染,在临床上对丙型肝炎的诊断有很大的应用价值。     

用PAGE电泳法检测腹泻婴幼儿粪便中轮状病毒RNA

目的　探讨婴幼儿轮状病毒感染诊断方法。方法　用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)检测轮状病毒RNA。结果　 41份腹泻婴幼儿粪便标本中有 16份为RNA阳性 ,阳性率为 39%。结论　用PAGE电泳方法检测轮状病毒RNA准确可靠 ,不易出现假阳性     

轮状病毒RT—PCR快速诊断方法研究

采用自制逆转录套式－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测婴幼儿病毒性肠炎粪便中的轮状病毒，结果阳性率为５６．５％（６１／１０８），显著高于采用ＰＡＧＥ，ＥＬＩＳＡ，ＬＡ检测的阳性率（Ｐ〈０．０１），而检测时间短，敏感性高，采用磷灰石抽提病毒ＲＮＡ的方法也优于其它三法试验盒的效果，国内尚未报道。     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的：在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin。方法：一步法抽提胎肝总RNA,RT－PCR扩增endostatin全基因,用T－A克隆技术的构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体。重组质粒分别以PCR,酶切及测序鉴定。电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞,SDS－PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白,MRR法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果：RT－PCR获得550bp的特异扩增条带,T－A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确。亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI,Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100％的正确,SDS－PAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/L NacL洗脱的蛋白峰大体外可转异性抑制血管内皮细胞的增殖。结论：在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白。     

高生物活性复合人工骨修复骨缺损的实验研究

目的：探讨载有转化生长因子β1（TGF－β1），具有高生物活性复合人工骨修复骨缺损的价值。方法：建立SD大鼠下颌骨缺损模型。采用组织学和分子生物学Slot Blot杂交法，检测羟基磷灰石复合TGF－β1实验组，单纯羟基磷灰石对照组，无材料修复的空白对照组在骨缺损愈合过程中的组织学及Ⅰ型胶原mRNA的表达状况。结果：实验组的新骨形成及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平最高。结论：提示栽有TGF－β1的高生物活性复合人工骨局部使用能促进骨愈合。     

原位逆转录PCR检测干细胞因子mRNA在白血病细胞的表达

目的：探索应用原位逆转录PCR（RT－PCR）检测低拷贝的干细胞因子mRNA在白血病细胞表达的可行性。方法：在普通的PE480型PCR仪进行原位RT－PCR，检测干细胞因子mRNA在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞的表达。结果：直接法和间接法原位RT－PCR法可以检测到干细胞因子mRNA在K562、HL-60和慢性粒细胞性白血病细胞表达，而常规的原位杂交则为阴性。结论：（1）干细胞因子在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞均有表达，但是表达量较低，应用原位RT－PCR可进行检测；（2）在普通的PE480型PCR仪上可以进行原位PCR。     

血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶靶向性抗肿瘤血管生成

目的：观察血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合肽－颗粒酶B（GraB）融合蛋白抗血管生成的作用。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT－PCR克隆GraBcDNA；抽提LoVo细胞总RNA，进行RT－PCR克隆VEGFR结合肽cDNA，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析表达产物，表达产物经亲和层析纯化后，以人血管内皮细胞（ECV304）和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，且具有抑内管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性，结论：VEGFR结合肽－GraB融合蛋白具有抑制血管生成的功能，在肿瘤生物靶向治疗中有一定潜在价值。     

RTPCR技术检测人B组轮状病毒的方法研究

目的：建立一种快速灵敏的方法来检测人B组轮状病毒。方法：参照文献，设计并合成了8对不同引物，利用RT-PCR技术同时扩增相应的基因片段。结果：经过一轮RT—PCR后，均扩增出与引物对应的大小不一的DNA条带。结论：由于常规B组轮状病毒的免疫诊断和聚丙烯酰胺凝胶电泳存在各自的缺点，不能很好的应用于临床和实验室诊断。RT-PCR是一种高灵敏度的检测方法，8对特异性引物同时用于人B组轮状病毒的检测，其灵敏度和特异度相当高，且使用一个配方和一样的扩增程序，这使得在实验室诊断变得更为便捷和简单。     

三种方法检测沙门氏菌的比较研究

目的探讨建立快速、准确的沙门氏茵检测方法。方法采用常规方法、Vitek免疫诊断分析系统（VI-DAS）和荧光RT—PCR对沙门氏茵进行检测，并对其灵敏性和特异性进行比较。结果荧光RT—PCR的灵敏度最高。VIDAS及荧光RT—PCR检测沙门氏茵的特异性均达100％。结论VIDAS及荧光RT—PCR均能对沙门氏茵进行快速检测，在应对突发公共卫生事件中将能发挥重要作用。     

胶体金法检测A群轮状病毒的结果与分析

目的：探讨婴幼儿A群轮状病毒（Rotavirus,RV）的实验室检查方法，为临床提供快速、准确、可靠的诊断依据。方法：采用A群轮状病毒胶体金法检测试剂对我院2007年秋冬季节门诊805例腹泻患儿进行大便A群轮状病毒抗原检测。结果：805份腹泻标本A群轮状病毒阳性率为35.9%，与文献报道结果相符。结论：胶体金法检测A群轮状病毒抗原快速、方便、准确、可靠，值得推广。     

高脂饮食对氧化修饰低密度脂蛋白和巨噬细胞集落刺激因子影响的实验研究

目的：探讨高脂饮食引起动脉粥样硬化的机理。方法：采用高脂饮食喂养小鼠，用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中OX－LDL含量；用RT－PCR法检测小鼠腹腔M－CSF mRNA的表达。结果：高脂刺激动物体内OX－LDL含量增加和M－CSF mRNA的表达的增强。结论：高脂刺激动物体内OX－LDL、M－CSF含量的升高，加速动脉粥样硬化的形成。     

儿童血流感染多重PCR检测方法的建立

目的：探索建立一种可快速鉴定儿童血流感染常见病原菌的多重PCR体系。方法通过16S rD－NA－PCR筛选出7种引起血流感染的常见病原菌,并针对这些病原菌设计特异性引物组合成多重PCR系统,检测该系统的特异性和敏感性;将该体系的检测结果与血培养及16S rDNA－PCR比较。结果该体系可以扩增出7种病原菌的特异性基因片段,病原菌检出率高于血培养且与16S rDNA－PCR差异无统计学意义,敏感性和特异性良好。结论本研究建立的多重PCR方法可快速、准确地鉴定引起儿童血流感染的常见病原菌,可作为快速检测方法在临床实验室中应用。     

荧光定量RT—PCR快速检测手足口病病原研究

目的建立荧光定量RT—PCR技术用于检测手足口病的肠道病毒。方法利用TaqMan技术，设计一对共引物及探针，建立、优化反应体系后，构建质粒标准品，利用10倍稀释法建立相对定量标准曲线，根据TCID。倍比稀释，建立灵敏度曲线。特异性检验后利用临床标本与传统的RT—PCR法进行比较。结果定量标准曲线的灵敏度为10^5／μl（R^2=0．999），PCR扩增效率为94％。灵敏度曲线显示检测到的最低浓度值为5．0TCID50／ml（R^2=0．99），PCR扩增效率为97．6％。荧光RT—PCR检出率为80．9％，显著高于RT—PCR（检出率为62．92％）。结论研究建立的荧光定量RT—PCR方法检测肠道病毒敏感性高、特异性好、效率高，可以作为肠道病毒的快速检测方法。     

ELISA法检测轮状病毒在小儿腹泻中的应用

目的探讨快速、准确、灵敏的ELISA法在检测轮状病毒抗原中的应用。方法采用深圳安群ELISA轮状病毒抗原检测试剂盒,直接检测294例腹泻患儿大便中的轮状病毒抗原。结果在294例小儿腹泻的新鲜粪便中,检出158例为轮状病毒抗原阳性,其阳性检出率为53.7%。结论该法对腹泻患儿粪便中轮状病毒的检测具有方便、快捷以及灵敏度和准确度高的优点,易于应用、推广。     

水中脊髓灰质炎病毒感染性、抗原性及核酸指标检测方法的评价研究

目的：建立水中脊髓灰质炎病毒1型（PV1）感染性、抗原性及核酸检测指标并比较三种指标的优缺点．方法：分别用蚀斑计数（PFUA）、免疫印迹（DIBA）和逆转录PCR（RT－PCR）三种方法检测病毒感染性、抗原性和核酸片段完整性，并比较各方法的敏感性和特异性．结果：RT－PCR对PV1有株特异性，DIBA则对PV1有型特异性，而PFUA对PV1无型间及株间特异性；PFUA，RT－PCR和DIBA对PV1Henan株（105TCID50／mL）最低检出稀释度分别为5×10-5，5×10-5和1×102．结论：PFUA有较高的敏感性，但存在缺乏特异性，sd～7d的检测时间及因需细胞培养造成的不易操作、高经费支出等缺陷．DIBA虽有型特异性，但敏感性差，目因靠肉眼判断结果判定误差大．RT－PCR结果快速、特异、敏感、操作简便、省时省力．     

新生儿轮状病毒无症状感染的聚合酶链反应研究

选用与 A 组人类轮状病毒(Human Romvirus,HRV)编码 VP7蛋白的第9基因(或8)两个保守序列互补的引物,建立检测 A 组 HRV dsRNA 的聚合酶链反应技术,扩增产物片段约342bp。经逆转录—聚合酶链反应(RT—PCT)检测18例无腹泻症状新生儿89份粪便标本,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法进行比较,结果前者检出 HRV 核酸54份(60.7%),而后者则检出35份(39.3%),PCR 结果可能比较接近新生儿排泌轮状病毒的实际情况。     

下丘脑褪黑素受体亚型基因及蛋白表达的研究

目的：应用PT－PCR技术和免疫组织化学染色显示人胚胎下捕脑褪黑素受体及其亚型的分布。方法：取人胚胎下丘脑组织，抽提总RNA并应用RT－PCR方法检测其mRNA，扩增所得阳性产物用自动测序仪测序；石蜡包埋下丘脑组织，应用鼠抗人mt1和MT2受体单克隆抗体分别检测褪黑素mt1和MT2受体亚型mRNA及其蛋白的表达。结果和结论：人胚胎下丘脑组织中存在mt1和MT2受体亚型mRNA的表达及其蛋白的翻译，提示在该组织中有mt1和MT2两种受体亚型的表达。     

荧光定量PCR检测食品中副溶血性弧菌方法的建立

目的：建立一种荧光定量PCR方法检测副溶血性弧菌,为食品安全监测、临床诊断提供快速、准确的检测方法。方法：选取副溶血性弧菌不耐热溶血毒素基因作为检测的靶片段设计引物及探针,通过体系优化建立检测副溶血性弧菌的荧光定量PCR检测方法。同时评价其特异性、灵敏度、重复性。并对临床收集的样本进行检测。结果：所建立的荧光定量PCR方法特异性高,可准确、特异的检测副溶血性弧菌,灵敏度为10cfu/mL;20份市售食品样本检测结果显示12例副溶血性弧菌阳性,结果符合常规培养检测结果。结论：所建立的荧光定量PCR方法具有快速、结果可靠、灵敏度高等特点,可用于食物污染物调查、临床检验等多个方面中副溶血性弧菌的检测。