超抗原SEB和SEC诱导的树突状细胞对T细胞的影响

目的：阐明超抗原葡萄球菌肠毒素B（SEB）和葡萄球菌肠毒素C（SEC）诱导树突状细胞(dendritic cells，DC)促进T细胞活化、增殖、分泌及其对肝癌HcaF细胞的杀伤作用。 方法： 以SEB或SEC诱导DC刺激T细胞，免疫组化染色检测DC表达S-100蛋白；流式细胞术检测DC表达I-Eκ和CD80分子水平，检测T细胞受刺激后CD69的表达、IL-2和TNF-α的生成；用MTT法检测T细胞增殖及其对HcaF细胞的杀伤效应。 结果： 体外试验表明，DC高表达S-100蛋白，SEB或SEC诱导的DC高表达I-Eκ和CD80分子；SEB或SEC能诱导DC促进T细胞活化，其浓度以100 μg/L时作用最强；SEB或SEC能诱导DC促进T细胞增殖、大量分泌IL-2和TNF-α, 被激活的T细胞对HcaF细胞的杀伤率高达83.2%±12.8%，明显优于肿瘤抗原诱导的DC所激活的T细胞对HcaF细胞的杀伤作用；SEB与SEC的诱导作用无明显差异。 结论： 超抗原SEB或SEC能诱导DC显著增强T细胞活化、增殖、分泌和杀伤肿瘤细胞，并优于肿瘤抗原的诱导作用，SEB和SEC的作用相似，为超抗原SEB或SEC与DC联合应用于临床肿瘤的治疗提供了证据。     

肝癌DC疫苗诱导CTL的效应与机理研究

目的 探讨肝癌DC疫苗诱导肝癌特异性淋巴细胞的效应与机理。方法 用流式细胞术检测肝癌细胞表面HLA-DR的表达；用GM-CSF和IL-4从健康人外周血诱导DC，使之负载肝癌相关抗原，并在BCG HSP-70作用下活化，制成肝癌DC疫苗；用流式细胞术检测BCG HSP 70活化的负载肝癌抗原DC对自身淋巴细胞的活化；分别用MTT法和ELISA检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞培养上清中TNF和IL-12水平；用原位杂交检测淋巴细胞内IFN-γ mRNA表达；用流式细胞术检测经DC疫苗活化后淋巴细胞表面Fas-L表达；最后检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤。结果 肝癌DC疫苗在体外诱导活化的淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤以CD4^ T CTL为主，不但可以杀伤SMMC-7721细胞，同时对其它3种肝癌细胞也有不同程度的杀伤。CTL培养上清液和细胞中可分别检测到TH1型细胞因子TNF和IFN-γ mRNA。Fas和Fas配体途径发挥了重要的作用。结论 为肝癌DC疫苗的进一步深入研究及今后的临床应用奠定了良好的基础。     

负载肝癌抗原的人树突状细胞生物学特性的研究

目的探讨负载肝癌抗原的树突状细胞(DC)对自身CIK细胞的诱导增殖能力和杀伤能力.方法从人外周血分离获得单核细胞,体外经重组细胞因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)培养获得DC,电镜观察其形态,流式细胞仪检测其表面抗原,混合淋巴细胞反应检测负载肝癌抗原DC诱导CIK细胞增殖活性,检测激活的CIK对肝癌细胞的杀伤作用.结果经体外培养,从外周血分离获得的大量成熟DC,检测表明高表达DC的抗原标志,负载抗原的DC具有很强的激发同种CIK增殖的能力,激活的CIK对肝癌细胞系具有很强的杀伤作用.结论实验结果为肝癌的临床免疫治疗提供了理论基础.     

NKG2D配体的表达直接影响NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤

目的:探讨NKG2D配体在不同发育阶段树突状细胞(DC)表面的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响.方法:用细胞因子(rh IL-4、rhGM-CSF、TNF-α)体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞(iDC)和成熟树突状细胞(mDC)并鉴定形态和表型,免疫磁珠法分离纯化NK细胞.流式细胞术(FCM)检测iDC和mDC表面NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3的表达.用LDH释放法检测NK细胞对iDC和mDC的杀伤活性以及抗NKG2D单克隆抗体(mAb)阻断NK细胞后的杀伤活性.结果:培养的iDC和mDC具有典型的细胞形态和免疫表型特征.iDC表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP3,表达率分别为(32.39±8.30)%、(17.75±3.40)%、(26.71±6.48)%、(38.37±6.89)%;mDC表面表达MICA 、ULBP3,表达率分别为(7.82±2.67)%、(8.36±2.42)%,比iDC表面相应配体表达率低(P<0.01).各效靶比NK细胞对iDC的杀伤活性均比对mDC的杀伤活性高,差异有统计学意义(P<0.01).抗NKG2D mAb阻断NK细胞后对iDC杀伤活性比阻断前减弱(P<0.05);对mDC的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(P>0.05).结论:NKG2D配体在iDC表面表达高,介导了NK细胞对iDC的杀伤,而对mDC的杀伤无影响,是NK细胞对iDC选择性高杀伤的分子机制之一.     

大鼠外周血及骨髓来源树突状细胞的培养及鉴定

目的培养及鉴定大鼠外周血及骨髓来源树突状细胞(DC)。方法分离大鼠外周血及骨髓单个核细胞,加入20 ng/m L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、10 ng/m L白细胞介素4(IL-4)培养10 d。流式细胞术检测CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)、整合素分子OX62的表达确定未成熟DC。成熟的DC在加入以上剂量的GM-CSF、IL-4处理基础上,再加入4μg/L肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理,流式细胞术检测CD80、CD86、MHCⅡ、OX62的表达,光镜及透射电镜检测细胞形态。结果流式细胞术检测结果表明,外周血来源的DC OX62表达较高、骨髓来源的DC的OX62表达较低,经TNF-α诱导后,外周血来源的成熟DC和骨髓来源的成熟DC的OX62水平均明显增加。两种方法提取的DC光镜下形态无差别,电镜下可见外周血来源的成熟DC的突起明显多于骨髓来源的成熟DC。结论外周血更容易获得和诱导高纯度的成熟DC。     

负载肝癌抗原的人树突状细胞生物学特性的研究

目的　探讨负载肝癌抗原的树突状细胞 (DC)对自身CIK细胞的诱导增殖能力和杀伤能力 .方法　从人外周血分离获得单核细胞 ,体外经重组细胞因子 (GM -CSF)、白细胞介素 - 4 (IL - 4 )、肿瘤坏死因子α(TNF -α)培养获得DC ,电镜观察其形态 ,流式细胞仪检测其表面抗原 ,混合淋巴细胞反应检测负载肝癌抗原DC诱导CIK细胞增殖活性 ,检测激活的CIK对肝癌细胞的杀伤作用 .结果　经体外培养 ,从外周血分离获得的大量成熟DC ,检测表明高表达DC的抗原标志 ,负载抗原的DC具有很强的激发同种CIK增殖的能力 ,激活的CIK对肝癌细胞系具有很强的杀伤作用.结论　实验结果为肝癌的临床免疫治疗提供了理论基础 .     

自体树突状细胞体外增强肿瘤患者引流淋巴结细胞抗肿瘤活性的作用

目的：探讨自体树突状细胞(DC)体外对胃腺癌患者肿瘤引流区)细胞抗肿瘤活性的增强作用。方法：分离肿瘤患者的外周血单个核细胞(PBMC)经IL-4、GM-CSF和TNF-α诱导其成熟，并以自体肿瘤冻融抗原预致敏，诱导其中的DC。另外，分离胃癌患者的TDLN细胞，在含有IL-2的培养体系中培养，并将TDLN细胞分为3组：(1)第1组为肿瘤抗原致敏的DC加TDLN细胞(D组)；(2)第2组为冻融的肿瘤抗原加TDLN细胞(Ag组)；(3)第3组不加DC及肿瘤抗原作为对照组(L组)。比较3组TDLN细胞对胃腺癌细胞系KATO3和黑色素瘤细胞系A375的杀伤作用。结果：D组对KATO3细胞系的杀伤作用明显优于Ag组与L组；而对A375细胞，各组细胞的杀伤作用没有明显差异。结论：自体DC可明显增强胃癌患者TDLN细胞的杀伤作用。     

TNF-α对兔软骨终板细胞增殖、凋亡及基质形成的影响

目的：探讨TNF-α对体外培养的兔软骨终板细胞增殖、凋亡及基质形成的影响。方法:分离培养并鉴定兔软骨终板细胞后，分别加入不同浓度的TNF-α，用 MTT测定不同时点软骨终板细胞增殖活性的变化；免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Fas、caspase-3 表达的变化；RT-PCR 检测培养过程中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原 mRNA 的表达变化。结果:50 μg/L、100 μg/L浓度TNF-α可抑制细胞增殖；50 μg/L浓度TNF-α可降低 Bcl-2的表达，10 μg/L、50 μg/L浓度TNF-α均可促进Bax、Fas、caspase-3 的表达；10 μg/L、50 μg/L浓度TNF-α可降低collagen IIa mRNA 的表达，TNF-α 为50 μg/L浓度时才可降低aggrecan mRNA 的表达。结论:TNF-α可抑制软骨终板细胞的增殖及基质合成，促进软骨终板细胞促凋亡因子的生成。     

肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导肺癌患者特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的：为了探讨肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力。方法：采用分离肺癌患者外周血单核细胞体外诱导DC细胞，Trizol法提取肺癌细胞系Calu-6总RNA，用脂质体包裹总RNA转染DC并诱导特异性CTL的扩增，LDH法和ELISA法检测CTL的杀伤活性和IFN-γ分泌。结果：经肺癌细胞总RNA转染的DC特异性表面标志及功能相关分子表达均上调，转染后的DC可显著刺激异体／自体T淋巴细胞增殖，诱导的特异性CTL对携带Calu-6抗原的靶细胞的杀伤率显著高于LAK细胞，再次接触相同抗原时其IFN-γ分泌量显著增高。结论：肺癌细胞总RNA转染的DC疫苗可在体外诱导出特异性抗肿瘤免疫。     

WT1多肽致敏树突状细胞诱导杀伤K562细胞实验研究

目的：研究来自健康人外周血单个核细胞的树突状细胞（DC）负载WT1多肽抗原，体外诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对K562细胞的杀伤作用。 方法： 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子，自外周血单个核细胞诱导扩增，培养出DC，使DC负载WT1多肽抗原。实验分3组，WT1多肽致敏DC为实验组A，未致敏DC为实验组B，单纯自体淋巴细胞未加DC激活为对照组C，观察CTL对K562细胞的杀伤作用。 结果： 培养出具有典型特征的DC，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为20∶1时，实验组A诱导的CTL对K562细胞的杀伤率为86.1%±26.8%；实验组B为47.1%±20.8%；对照组C为27.7%±15.3% (P＜0.05)。 结论： WT1多肽抗原致敏DC能促使CD8阳性淋巴细胞扩增，并诱导激活特异性CTL，对K562靶细胞具有明显的杀伤作用。     

腺病毒介导HSP70-HBsAg嵌合基因转染树突状细胞及生物学特性分析

目的 分析携带热休克蛋白70(HSP70)和乙肝表面抗原(HBsAg)嵌合基因的腺病毒表达载体感染人外周血诱导培养树突状细胞(DC)后其生物学特性的改变.方法 从正常人外周血中分离单个核细胞,经Ad-HSP70-HBsAg感染刺激后.在含细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的培养液体中体外诱导培养DC;采用荧光倒置显微镜、RT-PCR、流式细胞仪(FACS)和混合淋巴细胞反应(MLR)试验对人外周血来源的DC进行生物学特性分析.结果 Ad-HSP70-HBsAg感染后的DC能够有效表达示踪蛋白GFP和转录基因HSP70-HBsAg,病毒感染组和对照组的DC在细胞形态、DC细胞表面分子表达和刺激同种异体的人外周血幼稚型T细胞增殖能力的方面无明显差别.结论 Ad-HSP70-HBsAg可有效转染DC,感染后的病毒对DC的生长和生物学特性无显著影响.     

自身骨髓瘤抗原致敏树突细胞介导特异性CTL反应的研究

目的：研究多发性骨髓瘤(MM)患者肿瘤冻融物致敏的树突细胞(DC)能否诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。方法：用MM患者骨髓CD34^ 细胞诱生DC。将MM患者骨髓瘤冻融物冲击致敏DC。MTT法检测骨髓瘤抗原致敏及非致敏DC诱导的自身T细胞对不同靶细胞(患者骨髓瘤细胞、K562细胞)的杀伤率。结果：骨髓瘤冻融物致敏DC诱导的自身T细胞对患者骨髓瘤细胞的杀伤远大于对K562细胞的杀伤。结论：患者骨髓瘤冻融物致敏的DC能有效诱导自身T细胞特异性抗瘤免疫。     

阿司匹林对树突状细胞成熟及免疫功能的体外研究

研究阿司匹林在体外对小鼠树突状细胞(mDC)成熟及免疫功能的影响。在骨髓来源未成熟树突状细胞培养过程中,加入不同剂量(1mmol/L、2mmol/L)的阿司匹林,观察DC形态。流式细胞仪检测各组mDC表面共刺激分子CD86、CD80的表达;台盼蓝染色测细胞活力;混合淋巴细胞反应(MLR)检测mDC对T淋巴细胞刺激能力;ELISA法检测MLR上清液中细胞因子。与对照组比,阿司匹林处理的DC(aspirin-DC)表面CD80、CD86表达明显降低(P<0.01);对T淋巴细胞刺激能力减弱;MLR上清液中炎性因子(TNF-α、IL-1β)明显减少(P<0.01)。结果:在体外培养过程中给予阿司匹林干预能够抑制mDC的成熟及功能,呈剂量依赖性;阿司匹林对DC功能的抑制可能是阿司匹林抑制炎症反应,治疗冠心病的机制之一。     

PD-L1和PD-L2在树突状细胞上的表达及其生物学意义

探讨小鼠髓系DC (CD8α )中PD L1和PD L2的表达及其在T淋巴细胞活化中的作用。采用mCD4 0L CHO和TNF α分别刺激凋亡肿瘤细胞负载DC 4 8h ;免疫荧光标记检测DC表型 ;RT PCR和realtime PCR检测PD L1和PD L2mRNA转录水平 ;ELISA测定IL 2的分泌水平 ;3 H TdR掺入试验和51Cr释放试验测定DC体外激发T细胞的增殖和细胞毒杀伤率。结果显示 :PD L1和PD L2随着DC的成熟呈上调表达 ,CD4 0配基化DC的PD L1和PD L2均为中度表达 ,TNF α激发的DC为高度表达 ,二者呈现差异性表达 (P <0 0 5 ) ;CD4 0配基化髓系DC分泌IL 2的量明显高于TNF α组 (P <0 0 5 ) ,体外刺激T增殖和激活CTL能力在CD4 0配基化DC组最高 (P <0 0 5 )。提示CD4 0配基化的小鼠髓系DC呈现PD L1和PD L2的中度表达 ,IL 2大量分泌 ,这些均有助于激发有效的特异性免疫应答     

Dendritic cell-associated lectin 2 (DCAL2) defines a distinct CD8α- dendritic cell subset

CLRs on DCs play important roles in immunity and are expressed selectively on certain DC subsets. Murine DCAL2 (myeloid inhibitory C-type lectin/Clec12a) is a type-II CLR with an ITIM. Using a mouse DCAL2-specific mAb, we found that DCAL2 is expressed at relatively high levels on APCs and that DCAL2 expression can be used to divide CD8α- DCs into DCAL2+DCIR2- and DCAL2-DCIR2+ subpopulations. CD8α-DCAL2+ DC, CD8α-DCIR2+ DC, and CD8α+DCAL2+ DC subsets each express different levels of TLRs and respond to unique classes of TLR ligands by producing distinct sets of cytokines. Whereas CD8α-DCAL2+ DCs robustly produce cytokines, including IL-12, in response to CpG, CD8α-DCIR2+ DCs produce only TNF-α and IL-10 in modest amounts when stimulated with zymosan. However, CD8α-DCIR2+DCs, unlike the other DC subsets, strongly up-regulate OX40L when stimulated with bacterial flagellin. As predicted from their cytokine expression, CD8α-DCAL2+ DCs efficiently induced Th1 responses in the presence of CpG in vitro and in vivo, whereas CD8α-DCIR2+ DCs induced Th2 cells in response to flagellin. Thus, CD8α-DCAL2+ DCs comprise a distinct CD8α- DC subset capable of supporting Th1 responses. DCAL2 is a useful marker to identify a Th1-inducing CD8α- DC population.     

激动型CD40单克隆抗体体外抑制结肠癌细胞增殖的实验研究

目的 探讨激动型CD40单克隆抗体在体外对结肠癌细胞增殖的抑制作用.方法 树突状细胞(DCs)经结肠癌冻融抗原致敏后予以不同条件激活,分为激动型CD40单克隆抗体组、阴性对照组及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)阳性对照组,诱导培养至第7天,用流式细胞仪检测各组DCs表面分化相关抗原CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,酶联免疫吸附测定法检测DCs培养液上清中白细胞介素-12(IL-12)的质量浓度,噻唑蓝比色法检测DCs体外刺激T淋巴细胞增殖的能力,进而检测DCs所诱导的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人结肠癌细胞HCT116的杀伤作用.结果 与阴性对照组相比,激动型CD40单克隆抗体组活化的DCs表面抗原CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达率均显著升高(均P＜0.05),DCs上清中IL-12的质量浓度亦显著升高((716.80±53.43) pg/ml比(405.51±12.17) pg/ml,P＜0.05),活化的DCs具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力(刺激指数2.006 2±0.438 3比1.365 0±0.209 8,P＜0.05),活化的DCs所诱导的CTL对HCT116细胞具有更强的杀伤作用(抑制率(66.08±0.41)％比(46.60±1.10)％,P＜0.05);而与TNF-α阳性对照组相比,其差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 激动型CD40单克隆抗体在体外可促进DCs的活化与成熟,进而诱导肿瘤特异性CTL的产生,从而抑制人结肠癌细胞HCT116的增殖.     

Differential effects of IL-12 on the generation of alloreactive CTL mediated by murine and human dendritic cells: a critical role for nitric oxide

We examined the mechanisms involved in interleukin (IL)-12-mediated suppression of cellular immunity in mice using allogeneic mixed leukocyte reaction (MLR) stimulated by dendritic cells (DCs) in vitro and compared the effect of IL-12 on MLR in mice and humans. Although IL-12 stimulated human MLR, the addition of IL-12 or interferon-gamma (IFN-gamma) resulted in a dose-dependent suppression of MLR in mice. The treatment with N(G)-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) completely abrogated IL-12- and IFN-gamma-mediated suppression of MLR in mice. Furthermore, IL-12 enhanced the alloreactive cytolytic T lymphocyte (CTL) induction in human MLR, whereas the addition of L-NMMA was required to generate alloreactive CTLs in the presence of IL-12 in mice. Nitric oxide (NO) was detected only in mouse MLR. Murine DCs could produce NO, but neither human CD34(+) cell- nor monocyte-derived DCs produced a detectable amount of NO. These results suggest that NO produced by DCs might play an important role in IL-12-mediated immune suppression in mice but not in humans.     

B7-1分子诱导体外抗肝癌免疫反应

目的：了解Ｂ７分子在体外抗肝癌免疫中的作用。方法：健康人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）与ＨｅｐＧ２／ｈＢ７－１，ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ及亲代ＨｅｐＧ２瘤苗混合培养（ＭＬＴＣ），检测淋巴细胞活化增殖能力，淋巴细胞ＨＬＡ－Ｉ类抗原的表达，培养上清ＩＦＮ－γ水平，ＴＮＦ活性及ＬＡＫ，ＣＴＬ细胞活性。结果：ＨｅｐＧ２／ｈＢ７－１瘤苗促淋巴细胞增殖最高达１４．６倍，明显高于ＨｅｐＧ２／ｎｅｏ和ＨｅｐＧ２瘤苗的作用     

冻融抗原负载树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤急性白血病细胞的实验研究

我们应用基因重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,基因重组人粒 /单细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)联合培养体系自健康志愿者骨髓单个核细胞诱导产生DC ,使其负载急性髓系白血病 (AML)细胞冻融抗原 ,体外诱导细胞毒性T细胞 (CTL) ,观察负载AML细胞冻融抗原后DC的状态对所激发的T淋巴细胞表型及功能的影响及CTL对AML细胞特异性杀伤活性。我们发现负载AML冻融抗原后DC的CD1a、CD83、CD86、CD11C、HLA DR表达率为较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,且负载AML冻融抗原的DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例 ,较诱导前明显增高 (P <0 .0 1) ,而负载AML细胞冻融抗原的DC诱导CTL对AML细胞有较强的杀伤作用 ,明显强于加或不加IL 2培养的T细胞对照组 (P <0 .0 1) ,而对K5 6 2细胞无明显的杀伤活性。通过以上实验我们认为经rhGM CSF ,rhIL 4培养产生的DC为CD14CD1a DC ,能诱导CTL对AML细胞产生明显的特异性杀伤作用 ,另外 ,负载AML细胞冻融抗原DC诱导的CTL中CD3 CD8 T细胞比例明显增高 ,提示CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中具有极其重要的作用。