随机引物多态性DNA及其在微生物分型中的应用

用于微生物分型的现代技术包括表型和基因型方法。随机扩增我态性ＤＮＡ是在ＰＣＲ技术基础上发展起来的一种新的基因分型法。主要特点是利用随机寡核苷酸引物扩增基因组ＤＮＡ片段，进而通过弟胶电泳分析其批纹图特征借以显示不同菌株间存在细微差别，这种方法简单、快速，现已在许多微生物分型中得到运用。     

红色毛癣菌随机扩增DNA多态性分型研究

目的研究红色毛癣菌ＤＮＡ分型并探讨ＤＮＡ分型技术在临床菌种鉴定以及流行病学中的应用。方法氯化苄法提取ＤＮＡ，并用随机扩增ＤＮＡ多态性（ＲＡＰＤ）方法对临床分离的３０株红色毛癣菌进行ＤＮＡ分型。结果红色毛癣菌具有独特而稳定的ＲＡＰＤ带型，３０株临床分离的红色毛癣菌可进一步分为９型，菌株间相似程度较高。在多数菌株ＤＮＡ扩增中，红色毛癣菌与有性型Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｂｅｎｈａｍｉａｅ和Ａ．ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉ均有较大的差异。同一患者不同部位取材的菌株间以及取自不同患者的菌株间ＤＮＡ型均可相同。结论ＲＡＰＤ方法揭示了红色毛癣菌ＤＮＡ型的独特性，为红色毛癣菌提供了鉴定与分型的标志，为进一步探讨感染来源、传播途径等流行病学研究奠定了基础     

核酸扩增技术在微生物检验上的评价

核酸扩增技术是１９８５年Ｓａｉｋｉ等创建。本来ＤＮＡ的复制均在细胞内，Ｍｕｌｌｉｓ等通过多聚酶催化的链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃａｔａｌｙｚｅｄｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）使ＤＮＡ在体外扩增成为可能。但是由于多聚酶不耐热，每一个循环反应必须添加多聚酶，手续繁复，因此在微生物检验中无实用价值。直至１９８９年发现了耐热多聚酶，使方法简化，且该法在样品中能测出极微量的微生物特异ＤＮＡ或ＲＮＡ，受到了国内外检验微生物学家的重视。大多数学者认为扩增技术应用在微生物检验上应受到一定限制，因为假…     

8种细菌随机扩增多态性DNA引物筛选与反应体系优化

随机扩增多态性ＤＮＡ(ＲＡＰＤ)是一种新兴的基因分型方法 ,可对细菌等病原微生物进行基因分型并广泛应用于分子微生物学的追踪调查及医院感染的分析[1 ] 。该方法的最大特点是可对模板序列未知 ,而随机引物可以是任意 1 0个ｂｐ的单链寡聚核苷酸片段。本研究以临床常见的 8种细菌为对象 ,各筛选 2 0 0条随机引物 ,并应用反应曲面设计 (ＲＳＤ)方案[2 ] 对反应体系中关键反应成分 (模板、引物及镁离子 )浓度进行了优化 ,旨在为相关细菌的ＲＡＰＤ反应体系标准化及分型提供科学依据。一、材料与方法1 .菌株 :大肠埃希菌ＡＴＣＣ 2 592 2和金…     

一步反转录PCR法从组织及细胞中扩增HEK5

聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术诞生后不久即用于ＲＮＡ的扩增［１］。这种方法需要首先将ＲＮＡ逆转录（ＲＴ）为ｃＤＮＡ链后再进行常规ＰＣＲ扩增，程序较繁琐，且需逆转录酶及ＲＮＡ酶抑制剂等成本较高试剂。有研究表明Ｔａｑ聚合酶及ＴｔｈＤＮＡ聚合酶有逆转录功能，且...     

金黄色葡萄球菌随机引物扩增DNA多态性的分型研究

随机扩增ＤＮＡ的多态性(ＲＡＰＤＤＮＡ)分型是近年来继质粒谱分析、脉冲场电泳、探针杂交等分子生物学分型方法之后,发展起来的又一基因分型技术,在建立后的短短几年内,它已在医院感染菌株基因多态性分析中,显示了巨大的优势。为此,我们对金黄色葡萄球菌进行ＲＡＰＤ基因分型,以探讨其在医院感染研究中的意义。一、材料与方法1菌株来源:1998年2月～1999年4月住广州市三所综合性医院患者,分别取自痰、血液、伤口分泌物、腹水等临床标本,经分离鉴定确定为金黄色葡萄球菌,共85株。医院感染72株,社区感染13株。由一个实验室统一鉴定到种。所有…     

反向聚合酶链反应扩增吉兰巴蕾综合征患者T细胞受体β链基因

目的　通过研究急性吉兰巴蕾（ 格林巴利） 综合征患者外周血Ｔ 淋巴细胞受体（ＴＣＲ）β链基因的重排情况,以进一步对其基因扩增产物进行序列分析。方法　分离６ 例患者外周血Ｔ 淋巴细胞,用异硫氰酸胍酚氯仿法提取细胞总ＲＮＡ。合成双链ｃＤＮＡ,用Ｔ４ＤＮＡ 聚合酶补平末端,在Ｔ４ＤＮＡ 连接酶的作用下进行环化。环化的ＤＮＡ 直接用作反向聚合酶链反应（ＩＰＣＲ） 的模板。扩增产物在１－８ ％ 的琼脂糖凝胶上进行电泳分离,溴化乙锭染色。结果　对每份患者标本均可以较好地扩增出重排的ＴＣＲβ链基因,而正常人组则未能扩增出任何产物。在反应中连接体系的ｃＤＮＡ 浓度对ＩＰＣＲ 的影响较大,过高的ｃＤＮＡ 浓度使有效的自身环化降低,而导致扩增效率的下降。结论　用ＩＰＣＲ 技术可以特异地扩增重排的未知的ＴＣＲβ链基因,该方法具有特异性高,易于操作的优点。     

多重PCR在幽门螺杆菌检测及分型中的应用

应用多重ＰＣＲ同时扩增１６ＳｒＲＮＡ和ｃａｇＡ基因来检测幽门螺杆菌感染及其分型。ＰＣＲ产物经ＤＮＡ序列测定证实为转异性扩增，敏感度为１０＾２ＣＦＵ／ｍｌ。４８株Ｈｐ菌株中，Ｉ型菌株（ｃａｇＡ＋）２６株（５４．２％）；５５０份胃粘液标本，Ｈｐ阳性（１６ＳｒＲＮＡ基因＋）２１６份（４７．５％），其中Ｉ型Ｈｐ１３９份（５３．３％）。     

RA538基因功能片段的克隆和对HL—60细胞的作用

ＲＡ５３８基因是用维甲酸在体外迫使食管癌细胞系发生终末分化，建立分化前后的ｃＤＮＡ库，进行递减杂交后分离所得。转移到食管癌细胞后可抑制其增殖，引起细胞脱落和死亡。测定和分析ＲＡ５３８ｃＤＮＡ序列，靠近５＇端有一个可能的蛋白编码区。为研究ＲＡ５３８基因的功能，用多聚酶链反应技术扩增分离了这个可能编码区ＤＮＡ序列，借逆转录病毒载体转入白血病细胞，发现对ＨＬ－６０细胞的生长有明显的抑制作用，提示它在肿     

一次腹泻病原菌的随机扩增多态DNA特征

ＲＡＰＤ(随机扩增多态ＤＮＡ)分析细菌基因组结构的突出优势是无须知道待测细菌的遗传背景 ,技术成熟简便 ,从扩增产物可以比较不同属、种、型及株系间的ＤＮＡ指纹特征。1 998年 6～ 1 0月 ,呼和浩特地区发生小儿急性肠炎 ,为进一步认识腹泻的病原菌 ,对保存菌株进行了ＲＡＰＤ分析。一、材料与方法1 2株福氏志贺菌 2ａ型、2株福氏志贺菌 6型和 5株奇异变形杆菌进行细菌基因组ＤＮＡ的ＲＡＰＤ分析。随机引物选择ＣｙｂｅｒＳｙｎ生物工程公司的ＣＹ1 0系列套式引物 ,ＰＣＲ扩增在ＰＥ 480型上进行。收集生长对数期菌体 ,0 .9%ＮＳ洗涤 2…     

RA538基因功能片段的克隆和对HL－60细胞的作用

ＲＡ５３８基因是用维甲酸在体外迫使食管癌细胞系发生终未分化，建立分化前后的ｃＤＮＡ文库，进行递减杂交后分离所得。转移到食管癌细胞后可抑制其增殖，引起细胞脱落和死亡。测定和分析ＲＡ５３８ｃＤＮＡ序列，靠近５＇端有一个可能的蛋白编码区。为研究ＲＡ５３８基因的功能，用多聚酶链反应技术扩增分离了这个可能编码区ＤＮＡ序列，借逆转录病毒载体转入白血病细胞，发现对ＨＬ－６０细胞的生长有明显的抑制作用，提示它在肿瘤基因治疗中有潜在应用价值。     

PCR定点诱变方法构建BCR—ABLcDNA竞争性PCR内参照物

本实验通过合成与原有下游引物（Ｂ）相似的一条新引物（Ｂ’）,经聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）扩增出比原ＢＣＲ－ＡＢＬｃＤＮＡ序列减少了４个碱基的参照物,达到定点诱变的目的。经酶切分析证明,两型ＢＣＲ－ＡＢＬｍＲＮＡ均可通过此方法得到相应的ｃＤＮＡ参照物。参照物和特测模板的共扩增产物可通过毛细管电泳达到基线分离,证明了其可行性。该参数物可用于慢性粒细胞白血     

微量聚合酶链反应对人类白细胞抗原的基因分型

目的 探讨应用于移植的人类白细胞抗原（ＨＬＡ）二类基因（ＤＲＢ／ＤＱＢ）快速分型新技术。方法 采用快速ＤＮＡ抽提技术,建立了ＨＬＡ＿ＤＲＢ／ＤＱＢ微量序列特异性引物聚合酶链反应基因分型方法,对１４２份供受者ＤＮＡ进行ＨＬＡ－ＤＲＢ／ＤＱＢ基因分型,并与单克隆抗体一叔法ＨＬＡ血清学分型技术进行对比研究。结果 应用微量ＰＣＲ－ＳＳＰ方法共检出１３种ＤＲＢ１等位基因和 ＤＱＢ１等位基因,与血清学分型结果     

深红沙雷菌染色体DNA分子生物学特性研究

院内感染流行病学调查方法已由生物学迈进到分子生物学领域。选用ＨｉｎｄⅢ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇｌ Ｉ和Ｘｂａ Ⅰ限制性核酸内切酶，对某院心外科６名患者术后感染和呼吸机三通接头分离的深红沙雷菌（ＳＲ），分别进行染色体ＤＮＡ酶切图谱（ＲＥＡ）分析，并应用ＰＣＲ技术，从Ｅ．ｃｏｌｉ中分别扩增出１６ｓ、２３ｓ核糖体核糖核酸（ｒＤＮＡ）基因。以［α＾３２Ｐ］ｄＡＴＰ经缺口平移法标记探针ｒＤＮＡ为广     

标准血清学法,单克隆抗体法和 NA法行HLA—A抗原分型的比较

目的：双盲比较研究血清学方法、单克隆抗体（单抗）方法和ＤＮＡ方法用于中国汉族人群ＨＬＡ－Ａ抗原分型的精确性。方法：研究样本２９６份,包括１４３名无关供者和１５３例等待肾移植受者。血清学方法为二步法微量淋巴细胞毒分型技术;单抗法为一步法单抗分型技术;ＤＮＡ方法采用顺序特异引物聚合酶反应（ＰＣＲ－ＳＳＰ）技术。结果：所有样本ＤＮＡ分型匀获得成功,重复率１００％,分型结果经标准ＤＮＡ验证和美国加州大学配     

杯状病毒基因组全长cDNA克隆的构建及感染性病毒RNA的体外转录

目的：构建猫环状病毒（ＦＣＶ）基因组全长ｃＤＮＡ克隆,体外转录感染性病毒ＲＮＡ作为研究人及其他杯状病毒的模型或载体。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增覆盖ＦＣＶ全基因组的３个首尾重叠的片段,分步插入到表达性载体中,构建全程ｃＤＮＡ克隆,体外转录ＲＮＡ〉并转染ＣｒａｎｄｅｌｌＲｅｅｓｅ猫肾（ＣＲＦＫ）细胞。结果：构输长ｃＤＮＡ克隆,体外转录并转染ＣＲＦＫ细胞成功,培养上清对ＣＲＦＫ细胞有感染性,使其出现病变     

一步短片段RT—PCR方法检测HCV RNA

目的：为了简化传统ＲＴ－ＰＣＲ操作步骤。方法：利用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶具有一定的反转录酶活性的特点，对ＨＣＶ ＲＮＡ短序列进行反转当，并对合成的ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。结果：本法简化了传统ＲＴ－ＰＣＲ操作步骤，提高了结果的稳定性。结论：本法可用于ＨＣＶ ＲＮＡ以及其它ＲＮＡ的临床诊断。     

凝血因子Ⅷ cDNA的克隆及分子裁剪

凝血因子Ⅷ基因的分子克隆是制备重组因子ＦⅧ及进行甲型血友病基因治疗的基础。本研究采用基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增，ｍＲＮＡ的逆转录酶／聚合酶链反应扩增以及基因组ＤＮＡ文库的筛选等多种技术，得到了编码Ｆ Ⅷ的合部ｃＤＮＡ片段，并剪接成了可供表达的两种Ｆ ⅧｃＤＮＡ分子：一种包括Ｆ Ⅷ全部编码序列，长７８２８ｂｐ。另一种是缺失编码大部分Ｂ结构域及部分轻链Ｎ端的缺友型，长５３２３ｂｐ。     

PCR扩增IS6110用于检测痰液中结核分枝杆菌的评价

为评价ＰＣＲ扩增ＩＳ６１１０检测结核分枝杆菌的特异性，用Ｂａｃｔｅｃ培养法对４５例可疑肺结核病人痰样品进行分枝杆菌检测；用４对分别针对ＩＳ６１１０不同区域引物和一对分枝杆菌属特异的１６ＳｒＲＮＡ基因引物对这４５例痰样品及其培养物和２７株已知分枝杆菌属菌株进行ＰＣＲ扩增检测。结果所有分枝杆菌ＤＮＡ均扩增出了１６ＳｒＲＮＡ基因片段，结核分枝杆菌ＤＮＡ均扩增出了ＩＳ６１１０的４个不同区域片段，非典型分枝杆菌ＤＮＡ均未扩增出ＩＳ６１１０片段，但存在假阳性和假阴性     

标准血清学法、单克隆抗体法和DNA法行HLAA抗原分型的比较

目的：双盲比较研究血清学方法、单克隆抗体（单抗）方法和ＤＮＡ方法用于中国汉族人群ＨＬＡＡ抗原分型的精确性。方法：研究样本２９６份，包括１４３名无关供者和１５３例等待肾移植受者。血清学方法为二步法微量淋巴细胞毒分型技术；单抗法为一步法单抗分型技术；ＤＮＡ方法采用顺序特异引物聚合酶链反应（ＰＣＲＳＳＰ）技术。结果：所有样本ＤＮＡ分型均获得成功，重复率１００％，分型结果经标准ＤＮＡ验证和美国加州大学配型中心双盲验证符合；１４９份样本亚洲板单抗法分型总误差率为２．７％，包括２６个单一位点中３个存在第２个位点，１个位点分型错误。血清学分型１４７份样本，８个位点判断错误，３０个单一位点中１３个存在第２个位点，２例杂合子经ＤＮＡ分型证实仅１个位点，总误差率１５．６％。结论：ＰＣＲＳＳＰ用于ＨＬＡＡ抗原分型快速、精确，明显优于血清学方法，适合于临床应用。大样本量的检测推荐采用亚洲板单抗法分型，对单一位点和判断困难者需要经ＤＮＡ分型确认