实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因方法的建立

目的 建立用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα mRNA的方法.方法 制备目的基因PML-RARα的RNA标准品及管家基因β-actin的RNA标准品.然后将目的基因PML-RARα和管家基因β-actin的标准品梯度稀释作为模板进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.利用成功构建的两个标准曲线测定APL患者的目的基因PML-RARα与管家基因β-actin的相对值,分析不同状态患者的微小残留病(MRD)水平是否有差别,从而指导临床的治疗.结果 用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10～5 μg NB4细胞cDNA中的PML-RARα融合基因,其重复性的循环域值(Ct值),管间、批间变异系数(CV)分别为2.2%、4.0%.结论 本研究所建立的实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好.应用本法检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因表达水平的改变,有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后.     

实时定量聚合酶链反应动态监测白血病治疗后微小残留病研究

目的建立急性早幼粒细胞白血病(APL)实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测方法,并检测APL治疗后微小残留病(MRD),评价MRD检测的意义。方法应用RQ-PCR对96例APL患者的骨髓标本进行分析,检测PML/RARa融合基因的转录水平。结果 (1)RQ-PCR与传统巢式PCR(RT-PCR)检测结果的差异有统计学意义(P<0.05),提示应用RQ-PCR检测PML/RARa融合基因转录水平的敏感性高于RT-PCR。(2)RQ-PCR可对PML/RARa融合基因进行定量检测,监测患者的PML-RARa融合基因拷贝数水平变化,结果显示初诊时较高,有效治疗后迅速下降,复发时又出现上升,提示若患者在完全缓解(CR)后PML/RARa融合基因拷贝数呈现上升趋势,其复发机率大。结论 RQ-PCR检测作为APL治疗后微小残留病检测的方法,准确可靠,可以判断治疗效果,预测疾病复发,早期给予干预治疗,有重要的临床应用价值。     

实时定量聚合酶链反应在急性早幼粒细胞白血病融合基因检测中的临床应用

目的 比较不同类型的逆转录荧光实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测急性早幼粒细胞白血病（APL）PML-RARα融合基因的方法.方法 建立荧光染料SYBR Green Ⅰ和Eva GreenRQ-PCR技术,同时检测56例APL融合基因PML-RARα的表达水平,并且与传统巢式PCR方法进行敏感度比较.选择10例初诊患者随机分为两组,分别给予维甲酸（ATRA）加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗.每3周抽取骨髓标本,检测治疗后PML-RARα表达的变化.结果 两种RQ-PCR的灵敏度均可达到50拷贝,稍低于巢式PCR,但RQ-PCR定量准确,不易污染.分别取10^3拷贝和10^7拷贝的PML-RARα质粒以及患者cDNA同时做8次SYBR-Green Ⅰ平行扩增,批内变异系数分别为7.31%、8.26%和5.02%.不同APL患者PML-RARα表达水平有较大差异,初诊患者PML-RARα/GAPDH比值介于0.018～0.799,中位值为0.070;使用这两种染料建立的RQ-PCR方法进行定量检测,荧光染料Eva-Green荧光强度高于SYBR GreenⅠ 4倍.对接受ATRA加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗两种不同治疗方案的APL患者动态观察发现,2～4周PML-RARα转录本均迅速减少,2个月后80%PML-RARα转阴,但两种治疗方式无明显差异.结论 RQ-PCR可以准确检测微小残留病（MRD）融合基因表达水平;Eva Green和SYBR Green Ⅰ都可以用于RQ-PCR,但是Eva Green更敏感高效;监测融合基因表达可以有效观察不同治疗方法的治疗效果.     

筑巢式RT-PCR检测早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的检铡急性早幼粒细胞白血病(APL)中染色体易位t(15；17)所形成的早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α(PML-RARα)融合基因转录本。方法筑巢式逆转录酶／多聚酶链反应(RT-PCR)。结果在30例APL中，L型18例，S型10例，另有两例完全缓解者(CR4年和6年)未检测到上述转录本。10例初治APL同时进行PML-RARα融合基因和细胞遗传学检查，10例患者均植铡刊PML-RARα融合基因，而只有6例检测到t(15；17)易位染色体。结论PML-RARα融合基因植铡在APL的诊断、疗效评价及MRD的监测中是一个快速、准确且灵敏的方法。     

实时定量PCR动态监测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的临床意义

目的:探讨实时定量PCR(RQ-PCR)监测PML-RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病(APL)中的临床意义.方法:采用实时定量PCR(RQ-PCR)法监测患者骨髓PMLRARα融合基因亚型及动态变化.结果:初发32例患者中28例(87.5%)患者PML-RARα融合基因阳性,其中长型(L)19例(67.9%),短型(S)9例(32.1%).23例(82.1%)患者初次诱导后完全缓解,其中L型18例(94.5%),S型5例(55.6%),L型完全缓解率优于S型(P＜0.05),而复发率和病死率均低于S型,但差异无统计学意义(P＞0.05).长期随访的28例完全缓解患者,4例分子学复发,其中1例发生于第一次完全缓解后3个月,诱导缓解治疗后达第二次完全缓解,随后3个月再次分子学与血液学复发,再次诱导后达第三次完全缓解;3例在第一次完全缓解后3、4个月复发,经1疗程诱导后缓解,随访结束时生存期已达24个月.结论:APL初诊时PML-RARα融合基因亚型的检测可在一定程度上提示疾病的预后.在完全缓解期定期监测PML-RARα融合基因,可尽早发现分子学复发,及时治疗,避免血液学复发.     

应用RT-PCR和荧光原位杂交监测急性早幼粒细胞白血病微小残留白血病

目的应用RT-PCR和荧光原位杂交技术(FISH)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内PML-RARα融合基因的表达,监测患者体内微小残留白血病的情况。方法采用全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)联合治疗APL,运用RT-PCR和FISH技术检测和分析APL患者体内诱导缓解后及巩固维持治疗后PML-RARα融合基因。结果 46例APL患者PML-RARα融合基因均为阳性,其中34例患者在诱导化疗结束达完全缓解后检测,25例(73.5%)患者基因检测呈阴性,9例(26.5%)患者RT-PCR和/或FISH检测阳性,融合基因阳性和阴性复发APL的预测值分别为44.4%和4.3%;31例再经ATRA及As2O3巩固及维持治疗后,27例患者达到分子生物学缓解,无复发病例,4例融合基因阳性患者,3例复发APL,其复发APL的阳性预测值为75%。结论 RT-PCR和FISH技术是非常有效的监测APL患者体内微小残留白血病的实验方法,其对疾病的诊断、治疗及预后评估具有重要临床价值。     

巢式RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的意义

目的 探讨巢式RT-PCR技术在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的价值。 方法 采用巢式RT-PCR检测218例初诊为APL患者的PML/RARα融合基因的表达水平及在部分患者的动态变化;随机选择39例APL完全缓解(CR)的患者,分别用流式细胞术(FCM)和巢式RT-PCR监测外周血或骨髓中的微小残留病(MRD)白血病细胞。 结果 在确诊的167例APL患者中PML/RARα融合基因阳性率为90.4%(151/167);39例APL-CR患者中PML/RARα融合基因阳性率76.9%(30/39);FCM和巢式RT-PCR监测APL-CR患者MRD有很好的一致性(P＞0.05)。 结论 巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性;对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。     

急性早幼粒细胞白血病PML—RARα融合基因检测的临床意义探讨

目的探讨PML-RARα融合基因检测在临床检查急性早幼粒细胞白血病（APL）治疗前后的意义。研究PML—RAR饯融合基因含量与急性早幼粒细胞白血病（APL）病变进程的关系。方法运用RT-PCR技术检测急性早幼粒细胞白血病患者治疗前后骨髓内PML-RARα融合基因含量。结果所有51例初诊为APL的患者均做PML—RARα融合基因检测,其中阳性4l例,阳性率为80．4％。初诊为APL的51例患者治疗18个月后（进行随访）,其中死亡3例,阳性3例,阳性率为5．9％。结论PML-RARα融合基因的检测对APL诊断具有重要价值。定期检测PML—RAR仅基因可尽早发现分子学复发以及时治疗,并避免血液学复发。     

应用实时荧光定量RT-PCR检测急性髓系白血病患者aml1／eto融合基因的临床意义分析

本研究目的旨在构建实时荧光定量RT—PCR（RQ—RT—PCR）方法检测用的aml1／eto融合基因的RNA标准品,并以此作为工具监测急性髓系白血病M2患者微小残留病（MRD）的状态。应用定性的RT—PCR筛选患者标本中的aml1／eto融合基因,经体外扩增转录,得到10^10拷贝数RNA标准品,并对37例患者骨影外周血标本进行了检测。结果表明：构建的RNA标准品具有线形良好的标准曲线,扩增效率较高,特异性较好;患者初诊组和复发组的目的基因aml1／eto的相对值的平均值高于完全缓解组（CR）（P〈0．05）;随访的患者中初诊时目的基因aml1／eto的相对值很高,完全缓解时降低,复发时明显升高。初诊和CR两个时间点目的基因aml1／eto的相对值相差2个数量级以上时,病人的复发危险性相对较小,如果aml1／eto基因的相对值持续升高,则提示患者的预后较差。结论：RQ—RT—PCR方法检测aml1／eto融合基因的敏感性和特异性比较高,可信度和稳定性较好;对aml1／eto融合基因阳性患者MRD定量动态监测有助于初步评价治疗效果,估计患者的复发危险度,因此有望成为确定强化治疗的时机、延长病人完全缓解期的重要手段。     

急性早幼粒细胞白血病亚砷酸治疗后的微量残留病检测

90%以上的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者存在特征性染色体易位t(15;17)(q22;q21),导致PML-RARα融合基因形成成为APL的特异性分子标志[1].近年来由于全反式维甲酸及三氧化二砷(ATO)的临床应用,使得APL疗效显著提高[2-5].然而微量残留病(MRD)是APL复发的根源.     

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因实时定量RT-PCR标化法和常规法计算的比较

目的 改进实时定量RT-PCR的检测计算方法,提高定量RT-PCR在急性早幼粒细胞白血病(APL)微量残留病变监测的临床应用价值.方法 采用实时定量RT-PCR和常规定性RT-PCR检测31例APL患者在治疗前后融合基因PML-RARα的表达水平,对两种计算方法进行比较:常规按照患者治疗前后自身比较计算(常规法)和治疗前标准化基线水平计算(标化法).结果31例患者采用两种定量计算方法结果近似,标化法计算结果示患者在治疗缓解、巩固治疗和维持治疗期间融合基因PML-RARα转录本对数下降值分别为(2.0±1.9)、(4.9±1.4)和(5.7±0.1),常规法计算结果为(1.9±1.9)、(4.8±1.3)和(5.7±0.4).在维持治疗阶段标化法定量RT-PCR的结果显示患者个体差异更小.按照标化法计算结果,次要分子生物反应(对数值≥3)和主要分子生物反应(对数值≥5)标准仍然适用.结论 采用标化法计算实时定量RT-PCR结果能较好的对APL患者的微量残留病变进行监测,一定程度上降低了患者个体差异对检测结果的影响,同时适用于治疗前标本缺如的患者.     

实时荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病患者TCR VγI-Jγ基因重排

目的　探索提高急性淋巴细胞白血病 (ALL)微量残留病 (MRD)检测技术。方法　构建实时荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测TCRVγI Jγ基因重排技术并定量分析 36例ALL患者的检测结果。结果　建立的实时荧光定量PCR方法的灵敏度为 10 -4水平。 36例患者荧光定量PCR方法检测结果初治组为 (7.38± 6 .6 5 )× 10 -2 ,完全缓解 (CR)组为 (1.0 2± 1.0 8)× 10 -2 ,造血干细胞移植(HSCT)组为 (3.89± 5 .6 5 )× 10 -3 。CR组和HSCT组TCRVγI Jγ基因重排水平显著低于初治组 (P值均为 0 .0 0 1) ,HSCT组MRD水平显著低于CR组 (P <0 .0 5 )。 6例HSCT后检测阳性病例中 2例MRD水平 <1× 10 -3 ,获长期无病生存 ,另 4例MRD水平较高患者一年内均出现复发。结论　所建立的实时荧光定量PCR方法简便、快速、灵敏及特异 ;实时荧光定量检测缓解期ALL患者MRD水平对预测预后有一定的意义     

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的临床研究

目的 研究急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因的亚型、变化及其临床意义。方法 采用筑巢式逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测初治APL患者PML-RARα融合基因,监测完全缓解者微小残留病灶。结果 32例初治APL患者PML-RARα融合基因均为阳性(100%),其中S型为25%,L型为75%。L型的复发率及早期病死率分别为12.5%、12.5%,显著低于S型的复发率及早期病死率(25%和37.5%)。L型患者的预后比S型患者好。采用全反式维甲酸(ATRA)及小剂量高三尖杉酯碱诱导治疗,缓解后分别用化疗与维甲酸交替进行强化治疗,使PML-RARα阳性率随缓解期的延长而逐渐降低。同时监测16例APL缓解患者,PML-RARα融合基因阴性患者可长期生存。结论 PML-RARα融合基因的检测对APL的确诊、预测预后具有重要的临床意义。     

维甲酸和砷剂联合诱导急性早幼粒细胞白血病中PML-RARα表达上调不影响预后(英文)

急性早幼粒细胞白血病(APL)接受维甲酸和砷剂诱导治疗早期的分子动力学及其临床意义尚不清楚。本研究对32例初治APL进行动态检测,利用实时定量PCR和间期荧光原位杂交(FISH)方法检测PML-RARα转录本水平(PML-RARα/ABL)和细胞遗传学。结果表明,诱导14 d时PML-RARα转录本水平比治疗前显著升高(40.10%和57.74%,P<0.01),诱导28 d和巩固治疗结束时PML-RARα转录本分别为:6.97%和0%。在诱导治疗14 d和28 d分别有65.62%和31.25%患者发生PML-RARα转录本增加。治疗前、诱导14 d和诱导28 d PML-RARα拷贝数/每个APL细胞为0.9,2.2,1.4(PML-RARα/ABL×2/APL细胞%)。中位随访时间为22个月,32例患者均无复发。结论:PML-RARα表达上调是急性早幼粒细胞白血病接受维甲酸和砷剂联合诱导治疗过程中一个普遍现象,对疾病预后无影响。     

一步法RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因

目的 建立一步法RT-PCR检测急性平幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者PML-RARα融合基因的实验方法并作相关性能评价.方法 设计两对特异性引物,用一步法RT-PCR法检测APL患者PML-RARα融合基因的三种异构体,并用NB4阳性细胞株做稀释试验,得出该方法 的最低检测限;同时对2006年以来华西医院确诊APL患者的PML-RARα融合基因检测和骨硅细胞形态学检查结果进行比较.结果 一步法RT-PCR法检测PML-RARa 融合基因的灵敏度可迭10-4水平;使用两对引物同时扩增,可检出PML-RARα融合基因全部三种异构体;62例经临床和骨髓形态学确诊为APL的患者,其PML-RARα融合基因阳性率为100%.结论 一步法RT-PCR检测APL患者PML-RARα融合基因有很好的灵敏度,临床符合度较高且操作简便快速,样本交叉污染可能性小,临床实用性较高.     

实时定量PCR方法检测急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因的评价

目的 应用"欧洲抗癌计划"所定的实时定量PCR(RQ-PCR)法检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML-RARα不同转录本异构体并对结果进行分析.方法 应用RQ-PCR法对30例不同类型(长型、短型和变异型)PML-RARα阳性APL患者的骨髓标本进行扩增,并对扩增结果进行凝胶电泳.结果 短型RQ-PCR体系能扩增出长型、变异型和短型PML-RARα转录本,变异型反应体系能扩增出长型和变异型PML-RARα转录本,长型反应体系仅能扩增出长型PML-RARα转录本;电泳及测序结果显示筑巢式PCR检测为长型PML-RARα的患者标本经短型RQ-PCR体系扩增后可见3条带(621、477和218 bp),筑巢式PCR检测为变异型PML-RARα的患者标本经短型RQ-PCR体系扩增后也可见3条带(567、423和218 bp).结论 RQ-PCR方法敏感、可靠,可用于APL患者微量残留病的随访监测,但用于前瞻性分子诊断时要对结果认真分析.     

实时定量RT-PCR方法检测初诊白血病患者常见分子标志物

目的 建立实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)方法,检测初诊白血病患者骨髓细胞中的常见特征性分子生物学标志物的表达水平,评价其在疾病诊断和微量残留病(MRD)监测中的意义.方法 设计TaqMan探针和引物,建立RQ-RT-PCR法对常见融合基因转录本(bcr-abl、AML-ETO、PML-RARα)和abl阳性模板进行扩增,检测202例初诊白血病患者的融合基因转录本含量.结果 初诊白血病患者中的融合基因表达水平以绝对量表示,bcr-abl转录本b3a2或b2a2型拷贝数为47 614.63,bcr-abl转录本e1a2型拷贝数为98 847.53,AML1-ETO转录本拷贝数为300 029.51,PML-RARα转录本拷贝数为25 506.28.以abl校正拷贝数(NCN)表示相对量,bcr-abl转录本b3a2或b2a2型为1.05、bcr-abl转录本e1a2型为0.91、AML1-ETO转录本为5.33、PML-RARα转录本为0.55.结论 以abl校正拷贝数计算融合基因表达水平,结果更准确、直观,优于绝对定量.同时,不同类型融合基因转录本在初诊白血病患者中表达水平不同.     

中期荧光原位杂交在急性早幼粒细胞白血病诊断和微小残留病检测中的应用

为研究中期荧光原位杂交(M-FISH)在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及其微小残留病(MRD)检测中的价值,应用17号全染色体彩涂探针对10例初诊时按细胞形态学诊断为急性髓细胞白血病(AML)的未治疗患者(初治APL 5例,复发APL 3例,AML-M1和AML-M5各1例)和10例治疗后获完全缓解(CR)的APL患者作了M-FISH检测,并与常规细胞遗传学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果相比较.10例未治AML中,7例M-FISH呈阳性结果,核型分析显示其中4例有t(15;17)易位,3例为正常核型,它们中除1例未检测外,其余6例的RT-PCR均检出PML/RARα融合转录本;3例M-FISH呈阴性结果,其中1例核型分析揭示del(2q)×2异常,RT-PCR显示PML/RARα融合转录本阳性,1例有复杂核型异常,RT-PCR显示PML/RARα融合转录本阴性,1例有t(9;22)易位,RT-PCR显示PML/RARα融合转录本阴性而BCR/ABL融合转录本阳性.后两者的诊断由AML-M3改正为AML-M2.10例CR后的APL核型分析均未见异常,而15次M-FISH检测有12次都发现1-5个阳性细胞,此与RT-PCR结果相一致.白血病复发见于其中1例,该例相隔13个月的两次检测均为阳性.上述结果表明,M-FISH对于APL的诊断及其MRD的检测有重要应用价值,它虽不如RT-PCR敏感,但由于它能定量检测增殖细胞内的染色体易位,似比RT-PCR更能预测白血病的复发.     

急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因首次转阴时间及其临床意义探讨

目的:为了观察和分析急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)PML/RARα融合基因首次转阴时间和首次转阴时间长短的临床意义。方法:选取我院初诊APL患者60例,按照APL临床路径行诱导缓解及缓解后巩固治疗和维持治疗;应用多重巢式PCR动态监测APL患者PML/RARα融合基因的表达水平变化,计算首次转阴时间,随访观察并评价首次转阴时间的临床意义。结果:除3例死亡和1例失访外,其余56例初诊APL患者经正规治疗后,其PML/RARα融合基因均在24至381 d之间首次转阴,平均首次转阴时间为(131±90)d。首次转阴时间在PML/RARα融合基因不同亚型之间存在差异,L型转阴时间较S型的短(P=0.032),而不同年龄、性别、危险度分层组别之间差异均无统计学意义。首次转阴后的56例患者分别随访25 d至1979 d,中位随访时间为946 d,其中1例133 d首次转阴患者维持3个月后转阳并且随后出现临床复发,其余55例患者均长期保持分子水平缓解。结论:初诊APL患者PML/RARα融合基因平均约在正规治疗后4个月首次转阴;不同基因亚型之间首次转阴时间存在差异。PML/RARα融合基因首次转阴时间可客观反映APL患者治疗后白血病细胞的消减水平,对临床治疗有提示作用,但不能作为判断预后的绝对依据;以PML/RARα融合基因动态监测微小残留病灶对分析APL复发具有重要的临床意义。     

PML-RARoL融合基因L型选择性剪接与急性早幼粒细胞白血病患者预后的关系

目的 探讨PML-RARα融合基因L型选择性剪接与急性早幼粒细胞白血病(APL)患者预后关系.方法 用RT-PCR方法检测33例APL患者PML-RARα融合基因,用UVP凝胶成像分析系统对各扩增条带即E5(+)E6(+)(第5外显子和第6外显子均存在),E5(-)E6(+)(第5外显子缺失)和E5(-)E6(-)(第5外显子和第6外显子均缺失)三条带型进行灰度扫描,计算各剪接体相对表达量;对各剪接体相对表达量、初诊时外周血白细胞计数及年龄三个因素进行单因素及多因素预后分析.结果 死亡组与第1次完全缓解(CR1)组相比,E5(-)E6(+)和E5(-)E6(-)剪接体相对表达量差异有统计学意义(P值均＜0.01),E5(+)E6(+)表达量差异无统计学意义(P＞0.05).死亡组E5(-)E6(+)、E5(-)E6(-)、E5(+)E6(+)相对表达量分别为0.23±0.12、0.58±0.18、0.20±0.09,CR1组分别为0.45±0.16、0.23±0.12、0.31±0.16.初诊时白细胞计数及年龄与预后无明显相关性(P值均＞0.05).Logistic回归多因素预后分析显示E5(-)E6(+)剪接体相对表达量与预后无明显相关性(B=3.475,P=0.492),而E5(-)E6(-)相对表达量与预后呈负相关(B=-19.660.P=0.046).结论 初诊时E5(-)E6(-)剪接体表达量较高的APL患者预后差.