神经营养因子促进视神经夹伤后视网膜生长相关蛋白-43表达

目的：观察大鼠视神经夹伤后视网膜的神经生长相关蛋白－43（growth associated protein-43,GAP-43)的表达变化及胰状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor CNTF)和腺病毒介导脑源性神经营养因子（adenovirally delivered brain-derived neurotrophic factor,Ad-BDNF)对视神经夹伤的保护作用。方法：在眼球后2mm处作视神经夹伤，制作SD大鼠视神经夹伤模型，通过巩膜进行玻璃体微量注射神经营养因子（neurotraphic factors,NFs)，应用免疫印迹法观察视网膜的GAP－43表达量的变化。结果：正常SD大鼠视网膜上GAP－43呈现低表达，分子量约为46．7ku；玻璃体注射CNTF，大鼠视神经夹伤后2周，GAP－43的表达增强（P＜0．05），玻璃体注射Ad-BDNF，在视神经夹伤后4周内GAP－43的表达增强（P＜0．05），但这种作用以视神经损伤后1周时最为明显。结论：玻璃体注射NFs能够在一定时间范围内促进神经夹伤的SD大鼠视网膜上GAP－43表达，其中Ad-BDNF的促进作用能够维持相对较长的时间。     

丙戊酸钠对大鼠视神经损伤后视网膜生长相关蛋白-43表达的影响

目的 研究丙戊酸钠对大鼠视神经损伤后视网膜生长相关蛋白-43（GAP-43）表达的影响,探讨丙戊酸钠在视神经损伤后的作用及其机制.方法 健康雄性SD大鼠60只（72只眼）,随机分3组：正常组（不做任何处理）12只（24只眼）、对照组（等量生理盐水腹腔注射）和治疗组（丙戊酸钠300 mg/kg腹腔注射）,每组24只大鼠（24只眼）.建立大鼠视神经不完全损伤模型,分别于损伤后3d、7d、14 d、21 d处死,光镜下观察视网膜神经节细胞的病理形态学变化,计算机图像分析技术和免疫组织化学技术半定量检测视网膜组织GAP-43的平均光密度值.结果 视神经损伤后对照组和治疗组视网膜神经节细胞数目均呈下降趋势.与对照组比较,治疗组视网膜神经节细胞空泡化程度轻,各层胞核排列相对密集整齐.治疗组GAP-43免疫组化染色的平均光密度值及阳性细胞计数均高于对照组.结论 由丙戊酸钠对视神经损伤后GAP-43表达的增强,可以推断丙戊酸钠对视神经损伤具有保护作用.     

慢性高眼压兔模型视网膜中生长相关蛋白-43表达的变化

目的:研究持续高眼压状态下视网膜中生长相关蛋白-4(GAP-43)表达的变化。方法:兔眼前房注射复方卡波姆溶液制成慢性高眼压模型(n=21),用免疫组织化学方法观察在高眼压不同时间段视网膜中GAP-43的表达变化。结果:正常兔眼视网膜内丛状层中存在GAP-43的表达。持续性高眼压7d后内丛状层中的GAP-43免疫反应产物密度增加,且在节细胞和神经纤维层也出现阳性产物,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。高眼压14d时阳性反应产物与7d时相比有所下降,但仍高于正常对照组(P<0.05);21d时基本恢复至正常对照组水平(P>0.05)。结论:慢性高眼压时视神经、视网膜结构受损,导致视网膜中GAP-43短暂升高。     

巨噬细胞激活促进视神经损伤后修复的研究

目的研究巨噬细胞激活状态与视神经损伤后视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)存活及神经轴突再生的关系。设计实验性研究。研究对象费希尔大鼠23只。方法在费希尔大鼠上建立视神经损伤及自体外周神经嫁接模型,在玻璃体腔分别注射巨噬细胞激活剂酵母多糖(zymosan,ZYM)或联合巨噬细胞抑制因子(macrophage inhibitory factor,MIF)。大鼠存活3周后灌流固定取视网膜,灌流之前3天进行荧光金标记。对取出的视网膜进行免疫荧光染色,平铺视网膜后在荧光显微镜下分别计数存活RGC、轴突再生性RGC和巨噬细胞的数量。实验分为生理盐水对照组、ZYM组、MIF组及ZYM联合MIF组。主要指标巨噬细胞、存活RGC及轴突再生性RGC的数量。结果对照组巨噬细胞、存活及轴突再生性RGC数量分别为91±6.1/mm~2、185±9.0/mm~2及35±2.9/mm~2,与对照组相比,ZYM组可使眼内巨噬细胞(883±93.9/mm~2)的数量增至近十倍,同时可明显促进RGC存活(299±13.1/mm~2)及神经轴突再生(99±13.5/mm~2);MIF组本身对RGC的存活及轴突再生情况无明显影响。当巨噬细胞被激活后,联合应用MIF虽未能减少眼内巨噬细胞的数量(828±72.9/mm~2),但可有效降低这些巨噬细胞对RGC轴突再生(67±2.2/mm~2)的促进作用。结论巨噬细胞被酵母多糖激活后具有促进RGC的存活及神经轴突的再生,而巨噬细胞抑制因子对巨噬细胞的抑制作用可使其促神经再生的作用明显降低。     

活化的巨噬细胞对钳夹伤大鼠视神经生长相关蛋白-43表达的影响

目的观察钳夹伤大鼠眼内注射酵母多糖后对视神经生长相关蛋白（gowth-associated protein-43,GAP-43）表达的影响,并探讨巨噬细胞所起的作用。方法大鼠视神经钳夹伤后,于左眼玻璃体腔注射酵母多糖5μL,右眼注射磷酸盐缓冲液5μL,分别于7d、14d和21d提取视神经蛋白行免疫印迹分析。结果酵母多糖处理眼中,GAP-43蛋白的表达显著增加,7d即升高,14d时明显增强,直到21d时仍保持较高水平,各时间点相对磷酸盐缓冲液处理眼均有显著性差异（P〈0.05）。结论酵母多糖玻璃体腔注射后,能诱导眼内巨噬细胞活化,活化的巨噬细胞能增强钳夹伤大鼠视神经GAP-43蛋白的表达,对视神经的再生修复可能有一定的促进作用。     

大鼠视神经损伤后视网膜CNTF及CNTFRα mRNA的表达

目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子及其受体在大鼠视网膜中的表达变化。方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。分别于伤后1、3、7、14、28d取眼球,以正常大鼠视网膜为对照,提取视网膜组织RNA,运用RT-PCR检测视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA的表达变化。结果在正常视网膜中存在CNTF和CNTFRαmRNA的表达,视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA表达量逐渐增加,第7d达到最高,第14d下降,具有统计学意义(P<0.01)。28dCNTF表达仍高于正常组(P<0.01)。结论视神经损伤刺激了视网膜细胞表达CNTF和CNTFRα增加,可能是视网膜神经元自我保护的一种反应。     

形觉剥夺性弱视幼猫视皮质17区生长相关蛋白-43的表达

目的　观察形觉剥夺性弱视动物模型应用左旋多巴（ｌｅｖｏｄｏｐａ,ＬＤ）治疗后视皮质１７区生长相关蛋白-４３（ｇｒｏｗｔｈａｓｓｏ-ｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ-４３,ＧＡＰ-４３）的表达,探讨ＬＤ对形觉剥夺性弱视视觉功能恢复作用的可能机制。方法　５０只４周龄幼猫,随机分为正常组、剥夺组、对照组、低剂量ＬＤ组及高剂量ＬＤ组共５组,每组１０只。通过单眼眼睑缝合制备形觉剥夺的弱视模型,观察不同干预条件下各组图形视觉诱发电位（ｐａｔｔｅｒｎｖｉｓｕａｌｅｖｏｋｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ,ＰＶＥＰ）的Ｐ１００波的峰时及振幅的变化。应用免疫组织化学法测定各组视皮层１７区ＧＡＰ-４３的差异。结果　８周龄时,剥夺组、对照组、低剂量ＬＤ组、高剂量ＬＤ组剥夺眼Ｐ１００波振幅比对侧眼及同周龄正常组幅值降低,潜时延长（均为Ｐ＜０．０５）;１２周龄时,低剂量ＬＤ组剥夺眼Ｐ１００波振幅增高,与对侧眼及同周龄正常组相比差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）,而Ｐ１００波潜时则未达到正常（Ｐ＜０．０５）;高剂量ＬＤ组剥夺眼Ｐ１００波振幅增高、潜时缩短,与对侧眼及同周龄正常组相比差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。８周龄时剥夺组视皮质１７区Ⅱ／Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ／Ⅵ层ＧＡＰ-４３免疫阳性细胞密度均低于正常组,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;１２周龄时高剂量ＬＤ组各层ＧＡＰ-４３免疫阳性细胞密度与正常组基本相等,差异无统计学意义（Ｐ＞０.０５）;对照组、低剂量ＬＤ组和正常组相比差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ＧＡＰ-４３在形觉剥夺性弱视形成过程中起一定的作用,ＬＤ对形觉剥夺性弱视视功能改善的机制是通过ＧＡＰ-４３表达的改变而实现的。     

视神经损伤后突触后密度蛋白-95在大鼠视网膜中的分布及表达研究

目的研究视神经损伤后突触后密度蛋白-95（PSD-95）在神经损伤后sD大鼠视网膜中的定位及表达的变化。方法采用钳夹法制作SD大鼠视神经损伤模型。分别于损伤后1d、3d、5d,7d及14d摘除眼球,以正常大鼠视网膜为对照,应用免疫组织化学方法和Westernblot法检测视神经损伤后PSD-95蛋白水平表达变化;免疫荧光双标技术检测PSD-95的细胞定位情况。结果在正常对照组中,视网膜外丛状层有大量的PSD-95存在。视神经损伤后,PSD-95在视网膜中的表达显著减少,损伤后1d,PSD-95在视网膜外层表达量最低,在损伤后7dPSD-95的表达恢复正常水平并维持到损伤后14d。免疫荧光双标染色结果显示视神经损伤后1dPSD-95与视杆细胞的标记物rhodopsin共定位减少,损伤后7d部分恢复。结论视神经钳夹伤导致了视网膜PSD-95表达量的减少和分布的改变,可能是视网膜神经元损伤后自我保护的一种反应。     

视神经损伤后发生非折叠蛋白反应的超微证据

目的:探索视神经损伤后视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)及其纤维渐进性死亡机制。方法:利用包埋前与包埋后免疫金细胞化学标记技术结合电镜观察研究大鼠(n=15)视神经钳夹损伤后RGC与视神经干少突胶质细胞内的非折叠蛋白反应(unfolding protein response,UPR)。结果:视神经钳夹后,需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE1)在RGC与少突胶质细胞内胶体金标记数目增多,在钳夹0.5d后RGC内即有显著地增加(18.4±5.1～30.4±7.2个,P<0.05),随损伤时间延长,增多更为明显,在钳夹3d后达高峰(48.5±9.7个),IRE1在视神经干上的少突胶质细胞内增多时程变化与在RGC内相似。IRE1在RGC与少突胶质细胞内胶体金标记颗粒分布部位距离ER管腔距离增加为特征,在钳夹0.5d内神经干少突胶质细胞以及视网膜RGC内均表现非常明显的距离增加。结论:视神经钳夹导致损伤细胞触发UPR,UPR可能参与视神经损伤后RGC及其纤维渐进性死亡机制。     

视神经损伤时视网膜睫状神经营养因子受体的表达

目的研究睫状神经营养因子受体于视神经损伤后不同时间在视网膜中的表达情况,探讨外源性的睫状神经营养因子在神经损伤疾病中的应用价值。方法采用钳夹视神经的方法建立神经损伤的模型,在损伤后1、7、14、28d获取视网膜,提取总RNA及总蛋白,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定视网膜中睫状神经营养因子受体(CNTFR)αmRNA的表达,用WesternBlot方法了解损伤后不同时间CNTFRα蛋白水平的表达。结果在正常大鼠视网膜内CNTFRαmRNA无表达,在损伤后的1、7、14、28d均有一定水平的CNTFRαmRNA的表达,与正常对照比较差别具有显著性意义(P<0.01);损伤后备时间均有CNTFRα蛋白的表达,但CNTFRα蛋白的表达较弱。结论神经损伤后CNTF的表达先短暂升高以后持续下调,而CNTFRα-mRNA在损伤后4周内均有一定量的表达,提示补充外源性CNTF可能改善神经再生的微环境而发挥保护效应。     

银杏叶提取物对大鼠视神经挫伤后视网膜形态及视神经GAP-43表达的影响

目的观察银杏叶提取物（EGb761）对大鼠视神经夹挫伤后视网膜形态学及视神经GAP-43表达的影响。方法SD大鼠60只随机分为正常组12只、对照组24只、治疗组24只。后两组建立视神经不完全损伤模型,从伤后1 h开始,隔日1次,对照组给予生理盐水球后注射,治疗组给予EGb761球后注射。在伤后3 d、7 d、14 d、28 d取材,HE染色观察两组视网膜形态学改变;RT-PCR检测两组视神经中GAP-43 mRNA的表达水平。结果各时间点视网膜病理学改变治疗组轻于对照组,GAP-43 mRNA的表达治疗组较对照组高（P〈0.05）。结论EGb761可以抑制神经节细胞的损伤,使视神经组织中GAP-43 mRNA表达增加,促进视神经夹挫伤后视神经的再生。     

大鼠视网膜发育过程中GAP-43表达的差异性

目的:研究GAP-43在正常大鼠视网膜发育过程中差异表达。方法:采用RT-PCR方法检测正常大鼠生后不同时期视网膜发育过程中GAP-43 mRNA水平的表达差异;通过免疫组化检测其蛋白水平的表达差异,并对实验结果进行统计分析。结果:大鼠视网膜GAP-43 mRNA表达量在生后逐渐升高,在P21表达量最多,之后逐渐下降,到成年时维持在一个较低水平。各组差异有统计学意义(P<0.01)。结论:正常大鼠视网膜发育过程中GAP-43 mRNA及GAP-43蛋白水平的表达在生后逐渐升高,之后逐渐下降。     

蛇毒神经生长因子对鼠视网膜神经节细胞GAP-43表达的影响

目的通过对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)的研究,观察蛇毒神经生长因子(venom nerve growthfactor,vNGF)在鼠视神经横断伤后对RGC的保护作用。方法将24只SD大鼠随机平均分为实验对照组、实验治疗组。各组右眼制作视神经横断伤模型,实验治疗组向玻璃体腔内注入0.8 g.L-1vNGF 0.025 mL,实验对照组向玻璃体腔内注入0.025 mL平衡盐液。左眼未做任何处理,作为正常对照组。于损伤后7 d、14 d取材,应用病理图像分析计数RGC及观察大鼠视网膜神经纤维层厚度变化,进行GAP-43免疫组织化学染色分析。结果光镜下,伤后7~14 d,实验治疗组大鼠RGC数目明显高于实验对照组,有非常显著性统计学差异(P<0.01),2组均比正常对照组RGC数目下降,有非常显著性统计学差异(P<0.01)。免疫组织化学结果:实验治疗组7 d时GAP-43表达明显,14 d时稍减弱;实验对照组7 d时有GAP-43表达,但较实验治疗组弱,到14 d时表达明显减弱。结论在视神经横断伤后,vNGF能增加并延长GAP-43的表达强度,提高RGC的存活数量,对RGC有明显的保护作用。     

Phenytoin blocks retinal ganglion cell death after partial optic nerve crush

Phenytoin is a well-characterized sodium channel blocker in widespread use as an anticonvulsant. In 1972, Becker and co-workers reported that phenytoin could reverse visual field loss from glaucoma. The authors therefore explored whether phenytoin could protect retinal ganglion cells from optic nerve crush. The optic nerve of Long-Evans rats was partially crushed; animals were given a single dose of either intraperitoneal phenytoin or vehicle. A third group underwent sham optic nerve crush. In a second set of experiments, the effect of phenytoin was compared to the N -methyl- D -receptor antagonist, memantine. Retinal ganglion survival was evaluated 1 week later. In addition, the effect of memantine and phenytoin on glutamate-induced intracellular calcium fluxes was evaluated.Phenytoin and memantine significantly reduced ganglion cell loss after optic nerve crush, and blunted the rise in intracellular calcium seen after administration of glutamate. Co-administration of the two agents, however, did not increase ganglion cell survival, and had no effect on ganglion cell calcium fluxes. Phenytoin can preserve retinal ganglion cells after partial optic nerve crush. This effect was not additive with a glutamate antagonist, suggesting that both agents alone are equally protective at saving the same population of ganglion cells at risk. In fact, the neuroprotective effect of the combined administration of phenytoin and memantine was significantly less than either of the two drugs alone. Phenytoin is known to decrease neuronal firing and neurotransmitter release; this may underlie its ability to serve as a neuro-protectant in this experimental paradigm.     

Activation of autophagy in the retina after optic nerve crush injury in rats

AIM: To investigate the activation of autophagy in rat retina after optic nerve crush (ONC) and evaluate its relationship with apoptosis of retinal ganglion cells (RGCs). METHODS: The ONC model was established. Western blots were performed to investigate expression of p62, LC3 and Beclin-1. Transmission electron microscopy was performed to discover the autophagosomes in the retina after ONC. Immunohistochemistry was used to confirm the distribution of LC3. TUNEL was performed to confirm the relationship between autophagy and RGC apoptosis. RESULTS: p62/Beclin-1 ratio was declined shortly after ONC until to day 7 after ONC and then restored to a normal level at day 21. There was an opposite change in the LC3-II/LC3I ratio in the retina compared to the p62/Beclin-1 ratio. Increased autophagosomes were found after ONC using transmission electron microscopy, and most of the LC3-stained cells were colocalized with RGCs and Müller cells. More LC3-immunoreactive cells and apoptotic RGCs were found on day 7 following ONC. CONCLUSION: Possible activation of autophagy in RGCs after ONC; autophagy mainly occurred in RGCs and Müller cells, and the apoptosis of RGCs after ONC may be partly associated with autophagic activation.     

大鼠视神经损伤后Toll样受体4在视网膜中的表达

背景Toll样受体4（TLR4）是一种重要的免疫相关受体,在多种疾病的发生中起致炎作用。研究发现,视神经损伤后继发的炎症反应可进一步引起视网膜损伤,因此视神经损伤后TLR4的表达及其效应值得研究。目的研究大鼠视神经损伤后视网膜TLR4的表达情况。方法选取成年健康SPF级SD大鼠24只,按随机数字表法随机分为视神经损伤3d组和视神经损伤7d组。取大鼠右眼用视神经钳夹法制备视神经损伤模型,左眼不予处理为对照组。分别于视神经损伤后3d和7d用过量麻醉法处死大鼠并分离视网膜,采用免疫荧光法检测各组大鼠视网膜中TLR4的表达;分别采用逆转录PCR法（RT—PCR）和Westernblot法检测大鼠视网膜中TLR4mRNA及其蛋白的表达;采用TUNEL染色法观察各组大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的凋亡情况。结果视网膜免疫荧光法检测结果显示,TLR4在大鼠视网膜中呈绿色荧光,视神经损伤3d组和视神经损伤7d组造模眼视网膜中的荧光强度较对照组左眼均明显增强,绿色荧光主要分布在视网膜内层。RT—PCR法检测表明,模型眼视网膜损伤后3d和7d视网膜中TLR4mRNA相对表达量分别为2．92±0．06和3．92±0．12,对照眼TLR4mRNA的相对表达量分别为2．87±0．12和3．44±0．17,大鼠模型眼TLR4mRNA表达的灰度值较对照眼明显增加,差异均有统计学意义（t3d=-12．888,P〈0．001;t7d=-4．669,P=0．010）。Westernblot法检测显示,大鼠模型眼视网膜损伤3d和7d视网膜中TLR4蛋白的相对表达量分别为1．14±0．05和1．49±0．03,对照眼TLR4蛋白的相对表达量分别为0．99±0．09和1．38±0．07,模型眼视网膜中TLR4蛋白表达量明显高于对照眼,差异均有统计学意义（t3d=-11．324,P〈0．001;t7d=-5．638,P=0．005）。TUNEL染色显示,模型眼RGCs凋亡数较对照眼增多。结论TLR4在视神经损伤大鼠视网膜内层的表达明显上调,提示TLR4通路可能参与RGCs的损伤。