重组融合蛋白Fab/IFN-αA的表达及其抗乙型肝炎病毒的作用

IFN-αA是治疗乙型病毒性肝炎有效药物,但由于其临床应用的副作用及持久应答率不超过50%,限制了其疗效的发挥[1].作者通过DNA重组技术和PCR技术将抗乙型肝炎表面抗原抗体片段Fab与IFN-αA在分子水平上进行重组,构建了人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αΑ-干扰素融合蛋白原核表达载体[2].本实验将筛选出阳性克隆的菌种进行诱导表达,测定表达的重组融合蛋白(Fab/IFN-αA)的IFN-αA活性及抗体Fab活性,并应用HBV DNA转染细胞系(HepG2215细胞系)作模型[3],通过检测Fab/IFN-αA作用后细胞上清液的HBsAg、HBeAg水平的变化,结合细胞存活率来评价其抗HBV作用,并与IFN-αA进行了比较.     

非竞争性ELISA法测定人源抗HBaAg Fab功能性亲和常数

目的 测定完全人源化基因工程抗体HBsAg Fab的亲和常数。方法 采用非竞争性ELISA同相法，经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后，得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAg Fab及完整抗体抗HBsAg IgG的抗原抗体结合反应曲线，计算出抗HBsAg Fab及抗HBsAg IgG的亲和常数。结果 人源基因工程抗体抗HBsAg Fab的功能性亲和常数在10^7～10^8M^-1水平，比完整抗HBsAg IgG仅仅小约1个数量级(10^8～10^9M^-1)。结论 该基因工程抗体与抗原结合能力较强，为今后开发府用Fab进行牛物导向治疗提供了理论基础。     

1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测

目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。     

隐匿性乙型肝炎病毒感染患者S基因突变特点分析

目的分析1例血清HBV DNA长期阳性但HBsAg阴性的隐匿性乙型肝类病毒感染(OBI)患者HBV S基因突变特点,揭示S基因突变与OBI发生及肝脏疾病进展的关系。方法收集该患者不同时间点的4份血清样本,扩增HBV S基因并进行克隆测序,挑选代表性突变株病毒基因构建重组载体并进行表型分析。结果从该患者4份血清样本中检出多种S基因突变形式,包括前S1区大片段缺失、s126–127"RPCMNCTI"插入突变、sQ129N、s131–133 TSM→NST和经典的sG145R突变等,其中s131–133 TSM→NST在前后4份动态样本的检测病毒克隆中所占比例分别为0%、26%、59%和74%;前S1区大片段缺失在4份样本检测病毒克隆中始终存在,所占比例分别为26%、17%、15%和21%。表型分析发现,sQ129N和s131–133 TSM→NST可以降低抗体对HBsAg的亲和力,增加病毒分泌;与野生株相比,前S1区大片段(nt 3046–3177)缺失病毒株复制力下降了43.7%,表面抗原启动子Ⅱ(SPⅡ)活性下降了97.2%;sG145R可降低病毒的分泌能力。结论此例HBV感染患者的长期OBI临床表现是由于其感染有多种S基因突变病毒株引起,其中一些S基因突变可以影响病毒的表型特点,可能与肝脏疾病进展密切相关。     

非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数

目的　测定完全人源化基因工程抗体HBsAgFab的亲和常数。方法　采用非竞争性ELISA固相法 ,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后 ,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAgFab及完整抗体抗HBsAgIgG的抗原抗体结合反应曲线 ,计算出抗HBsAgFab及抗HBsAgIgG的亲和常数。结果　人源基因工程抗体抗HBsAgFab的功能性亲和常数在 10 7～10 8M 1水平 ,比完整抗HBsAgIgG仅仅小约 1个数量级 (10 8～ 10 9M 1)。结论　该基因工程抗体与抗原结合能力较强 ,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础。     

HBsAg阴性患者HBV隐匿性感染:110例临床分析

目的分析隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)患者的临床特征。方法纳入2012年3月—2014年1月于重庆医科大学就诊的HBs Ag阴性、HBV DNA在检测值以下的乙肝患者110例。采用高纯度病毒核酸检测试剂盒提取血清HBV DNA,采用巢式PCR对HBV基因组C、S、X区进行扩增。对不同性别、年龄及血清学模式[单独抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者,以及不同病因所致肝损害患者的OBI发生率进行分析。结果以巢氏PCR结果2个或2个以上区段同时阳性判定为OBI,110例入选患者OBI阳性率为23.6%(26/110);不同性别、年龄段、血清学模式患者OBI发生率差异无统计学意义。肝功能异常组OBI发生率明显高于正常组(35.1%vs 11.3%),两者比较差异有统计学意义(P<0.01);不明原因肝损害及有明确病因肝损害的OBI发生率分别为31.0%(9/29)和39.3%(11/28),差异无统计学意义。结论在HBs Ag阴性患者中,OBI更易发生在有肝功能损害的患者。当HBs Ag阴性患者肝损害原因不明时,应及时采用高灵敏HBV DNA检测方法以排除HBV隐匿性感染。     

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。     

聚乙二醇干扰素α2a治疗慢性乙型肝炎病毒学应答的相关分子研究

目的 探讨聚乙二醇干扰素α-2a(PEGIFN)治疗慢性乙型肝炎的病毒学应答差异与治疗前宿主细胞3种干扰素作用相关分子ISG15、OAS2和IFNAR1 mRNA表达水平的关系.方法 收集2006年7月-2008年12月在解放军第302医院门诊就诊的28例慢性乙型肝炎患者PEGIFN治疗前的外周血单个核细胞(PBMC).将治疗后6个月HBVDNA载量(拷贝/ml)下降≥2log10,同时有血清ALT显著下降者列入病毒学应答组(n=16),其余列入无应答组(n=12).应用实时荧光定量PCR法检测患者PBMC中ISGl5、OAS2、IFNAR1的表达水平.根据公式k=-(1/log10E)判断待测基因与GAPDH的扩增效率是否一致,并计算相对表达量.结果 ISG15、OAS2、WNAR1与GAPDH的扩增效率分别为2.15、2.21、2.20、2.19;扩增曲线相关系数分别为0.995、0.973、0.997、0.997,扩增效率较一致,可以用2-△Ct方法进行分析.应答组和无应答组的ISG15表达水平分别为0.007±0.006,0.090±0.080;0AS2分别为0.004±0.004,0.022±0.019;WNAR1分别为0.230±0.160,0.023±0.017.其中,应答组ISG15和OAS2的表达水平显著低于无应答组(P<0.001),IFNARl水平显著高于无应答组(P<0.001).结论 在PEGIFN治疗前对患者PBMC进行ISG15、OAS2和IFNAR1mRNA表达水平的定量检测有助于预测PEGIFN疗效.     

基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立

目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。     

重组融合蛋白Fab／INF—αA的表达及其抗乙型肝炎病毒的作用

ＩＦＮ－αＡ是治疗乙型病毒性肝炎有效药物,但由于其临床应用的副作用及持久应答率不超过５０％,限制了其疗效的发挥［１］。作者通过ＤＮＡ重组技术和ＰＣＲ技术将抗乙型肝炎表面抗原抗体片段Ｆａｂ与ＩＦＮ－αＡ在分子水平上进行重组,构建了人抗乙肝表面抗原抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素融合蛋白原核表达载体［２］。本实验将筛选出阳性克隆的菌种进行诱导表达,测定表达的重组融合蛋白（Ｆａｂ／ＩＦＮ－αＡ）的ＩＦＮ－αＡ活性及抗体Ｆａｂ活性,并应用ＨＢＶＤＮＡ转染细胞系（ＨｅｐＧ２２１５细胞系）作模型［３］,通过检测…     

α-干扰素治疗重型肝炎疗效初步观察

近年,在常规综合治疗基础上加用干扰素治疗重型肝炎,并与同期收治的未加用干扰素的病例作对照观察,初步看到干扰素治疗组对顿挫病情、减少感染性并发症及降低病死率有一定作用,现将结果报道如下.     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。     

庚型肝炎病毒感染对慢性乙型肝炎的临床与病理学影响

为观察庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染对慢性乙型肝炎（ＣＨ－Ｂ）的影响,对近年来收治的ＣＨ－Ｂ患者１２１例血清标本进行了ＨＧＶ－ＲＮＡ检测,并将其中合并与未合并ＨＧＶ感染者进行了临床与病理学对比研究,现报道如下。１材料与方法１．１对象１２１例患者以血清ＨＧ...     

轻链替换文库对抗HBs基因工程Fab抗体亲和力的影响

目的测定轻链替换文库对基因工程Fab抗体的亲和力的影响。方法将PCR扩增的人抗体轻链基因插入已克隆有人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体重链Fd基因的噬菌粒中,构建成轻链替换文库,经亲和淘洗,从该文库中筛选与重链Fd基因相匹配的轻链基因。结果链替换的噬菌体抗体(phab)的ELISA光吸收值(A)从0·43±0·09提高到最高为1·24±0·10。序列分析ELISA光吸收值(A)最高的5株phab的轻链基因,3株κ链的碱基序列基本一致,属VκIII亚群,2株λ链的基因序列相同,属VλⅠ亚群。结论所筛选出来的phab具有抗HBsAg的特异性。     

乙型肝炎病毒与宿主天然免疫间的相互作用

天然免疫是机体对抗病原体的第一道防线。病原体入侵后,通过相应的配体受体反应及信号转导,导致机体合成一系列细胞因子,建立广泛的防御机制。其中干扰素是起关键作用的细胞因子,它抑制病原体复制,防止病原体扩散,并影响机体的生理状态。乙型肝炎病毒（HBV）的感染也引起宿主的天然免疫反应,对HBV的复制发挥了不容忽视的抑制作用;另一方面,HBV对天然免疫也有抗击机制,保护病毒自身的生存和复制。HBV与机体天然免疫间的相互作用是非常复杂的。尽管目前对于HBV天然免疫的研究还存在诸多疑问,但在许多方面已取得一定进展。本文将阐述乙型肝炎病毒感染天然免疫方面的研究进展,重点讨论干扰素的作用及病毒对它的拮抗。     

飞行人员HBsAg携带者的健康鉴定

目的 了解飞行人员HBsAg的携带率及知晓率,探讨飞行人员HBsAg携带者的健康鉴定及日常航卫保健原则。方法 1992～1993年到我院健康疗养的512名飞行人员,采用ELISA法检测乙肝病毒感染的血清标志物HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc。结果 HBsAg的携带率为6.84％,其中有4名主动要求检测,知晓率为0.78％。结论HBsAg携带者的飞行健康鉴定,在关注症状、体征及肝功能的同时,应考虑病毒复制的状况。病毒性肝炎治愈后,地面观察的时间应视疾病过程决定,不宜统一限定在一年左右。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1相互作用蛋白的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节蛋白(HBVDNAPTP1)相互作用的蛋白.方法 将HBVDNAPTP1基因片段插入酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达,与含有白细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,利用营养缺陷型培养基筛选阳性克隆.提取单个阳性文库质粒进行酶切鉴定,测序后回复验证其在酵母中的相互作用.利用免疫共沉淀方法进一步验证HBVDNAPTP1与成对免疫球蛋白受体α(PILRα)在体外的相互作用.结果 经RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,成功构建HBVDNAPTP1基因的酵母细胞"诱饵"表达质粒,获得了与HBVDNAPTP1具有相互作用的已知功能蛋白4种,分别为PILRα、酶原颗粒蛋白16、羧酸脂酶1、β转导素样蛋白2.免疫共沉淀结果表明HBVDNAPTP1与PILRα在体外存在相互作用.结论 获得了4种可与HBVDNAPTP1相互作用的候选蛋白,HBVDNAPTP1可能参与了肝细胞的增殖分化、信息传递和生长代谢.     

HBsAg和抗HBs双阳性慢性HBV感染患者S区主要亲水区新增N-糖基化突变与肝细胞癌发生风险的相关性研究

目的 探讨临床HBsAg和抗HBs双阳性(简称双阳性)慢性HBV感染患者病毒S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变与肝细胞癌(HCC)发生的相关性.方法 纳入2009年7月-2015年6月在解放军302医院就诊的284例双阳性慢性HBV感染患者,通过巢式PCR方法扩增血清样本HBV S基因全序列并进行测序,分析MHR新增糖基化突变和其他临床指标与HCC发生的相关性并动态分析18例双阳性HCC患者临床确诊HCC前后S区新增N-糖基化的突变情况.结果 多因素分析表明,患者年龄＞40岁、HBsAg＞中位数、HBeAg阴性和MRH新增N-糖基化突变是双阳性慢性HBV感染患者发展为HCC的危险因素(分别为OR=4.281,95％CI 1.843～9.941,P=0.001;OR=3.146,95％CI 1.633～6.060,P=0.001;OR=2.097,95％CI 1.010～4.357,P=0.047;OR=4.381,95％CI 1.842～10.417,P=0.001),而丙氨酸氨基转移酶(ALT)、抗HBs＞中位数、抗HBe阳性和HBV DNA水平与HCC发生均无显著相关性.动态研究结果表明,18例双阳性HCC患者样本中有8例在发生HCC 1～4年前已携有新增N-糖基化突变.结论 在双阳性患者中HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HCC发生密切相关,HBsAg和抗HBs双阳性叠加MHR新增糖基化突变可作为慢性HBV感染患者HCC发生风险的预测指标.     

Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA 疫苗免疫反应的研究

目的:观察热休克蛋白65的真核表达载体(pHSP65)对HBV DNA疫苗诱导BALB/c小鼠(H-2d)免疫应答的调节作用。方法:肌内注射空载体pcDNA3,HBV DNA疫苗加HSP65佐剂(pHBVS2S pHSP65)或不加佐剂(pHBVS2S);ELISA法测定血清抗HBs抗体;ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性。结果:HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组,但无显著性差异;其IgG1/IgG2 a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.395与10。佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2~3倍。CTLs细胞杀伤活性(E∶T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:(53.68±7.5)%、(42.81±7.7)%,差异显著(P<0.05)。结论:HBV DNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应;HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。