人乳头瘤病毒6b型L1基因的克隆及表达

目的研究尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒(HPV)6b型晚期基因L1(HPV6bL1)在真核细胞内的表达。方法 PCR技术扩增原核重组质粒PQE40-HPV6bL1中L1基因,酶切后与真核表达质粒PEGFP-C1连接,转化入感受态大肠埃希菌DH5α,经扩增后酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序。以重组质粒PEGFP-HPV6bL1转染COS-7细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达,RT-PCR检测HPV6bL1 mRNA的表达。结果双酶切及测序鉴定显示,重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,PEGFP-HPV6bL1构建成功。重组体成功转染进COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR检测到HPV6bL1 mRNA的表达。结论建立了HPV6bL1绿色荧光真核表达系统,为研究该蛋白质的功能奠定了基础。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建表达肠毒素大肠杆菌(ETEC)定居因子CS6的重组质粒，并在大肠杆菌DH5d中高效表达。方法：利用基因工程的方法，将含有cS6基因的质粒pMG233用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切，得到长约3．1kb的CS6片段(含有cS6结构基因及调控基因的DNA片段)；并与用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切的表达载体质粒pBV321连接．得到含有CS6片段的重组质粒pMG235，转化至大肠杆菌DH5a。结果：SDS-PAGE、Western印迹及免疫荧光观察的结果表明，重组菌DH5a／pMG235可高效表达相对分子质量为14600的CS6抗原蛋白，并在重组菌表面表达，表达产物可被抗CS6多克隆抗体识别。结论：重组菌可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6。     

胶原沉积抑制因子cDNA的分子克隆及其在大肠杆菌DH5α的表达

目的：获取胶原沉积抑制因子（Deeorin）互补脱氧核糖核酸（cDNA）并在大肠杆菌DH5α中表达出成熟蛋白。方法：用巢式逆转录聚合酶链反应（nest-RT-PCR）法从体外培养的成纤维细胞（2BS）中获取Deeorin cDNA，克隆入pMD18-T载体。测序后，将成熟蛋白区亚克隆入pGEX-4T-1中，用PCR法、限制性酶切和测序对融合克隆进行鉴定。经过鉴定的融合克隆在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：获取的1181bp的Decorin cDNA片段与基因bank中收录的序列相似性达99．75％：可从GST-Deeorin成熟蛋白cDNA融合克隆中扩增出和酶切出1005bp的目的片段；融合克隆有完整的开放阅读框架；融合蛋白在大肠杆菌DH5α中成功表达。结论：获取了Decorin cDNA并在大肠杆菌DH5α中表达出GST-Deeorin成熟蛋白。     

耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达

目的扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础。方法以无任何突变的pGEX-6p-1-pprM重组质粒为模版,设计引物PCR扩增pprM基因,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1,将双酶切产物进行连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素（Kan）抗性的Luria-Bertani（LB）固体培养基上进行筛选,所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR,EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切及测序鉴定。通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达。裂解细胞抽提蛋白,Western blot进一步验证PprM蛋白的表达。结果菌落PCR结果及双酶切结果显示,在400 bp左右处有一条明显的目的条带,测序结果显示碱基序列与原基因序列一致,载体构建成功。荧光拍照结果显示,pEGFP-C1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白;Western blot结果显示在40×103处有融合蛋白表达。结论笔者成功将所构pEGFP-C1-pprM重组质粒转入293T细胞,并表达相应蛋白,为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础。     

MARCH1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建MARCH1真核表达载体并进行鉴定和纯化,为研究MARCH1在小鼠树突细胞(DCs)中的生物学作用奠定基础.方法 从小鼠尾部提取cDNA作为模板,采用特异的引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增MARCH1cDNA片段,经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,连接于载体pMB-HA质粒上,构建重组载体,经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果,转化大肠埃希菌DH5α感受态菌、筛选阳性克隆、抽提质粒并进行纯化.结果 PCR获得与预期大小一致(约3900bp)的cDNA片段,成功构建重组载体pMB-HA-MARCH1,双酶切及测序鉴定证实MARCH1 cDNA片段正确插入该真核表达载体中.结论 成功构建含有MARCH1的真核表达载体,为进一步研究提供了实验基础.     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究

目的 在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因.方法 以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列.酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD.结论 成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达.     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

人骨形成蛋白2的基因的克隆和序列分析

目的 克隆人骨形成蛋白2基因全长。方法 以成骨肉瘤细胞总RNA为模板，应用转录酶-多聚酶链反应法克隆人骨形成蛋白2的cDNA全长；将获得的基因插入pGEM—T—Easy载体质粒，并转化至大肠杆菌后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶酶切分析鉴定重组质粒。结果 通过质粒酶切分析和序列测定，我们获得的基因为人骨形成蛋白2全长DNA序列。结论 克隆获得人骨形成蛋白2的基因，为其进一步开发利用提供了前提条件。     

可溶性白细胞分化抗原40配体原核表达载体的构建与鉴定

目的构建原核表达载体pGEX4T含人可溶性白细胞分化抗原40配体(soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand,sCD40L)重组质粒。方法通过反转录 聚合酶链反应扩增,获得人sCD40L的基因片段;将其连接入T载体,用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷与异丙基-β-D-硫代半乳糖苷筛选阳性克隆,鉴定正确后经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,再与pGEX-4T原核表达载体连接,最后经酶切及测序鉴定。结果以L02细胞的互补DNA为模板,扩增出474 bp的目的基因;将目的片段与T载体连接并进行蓝白筛选得到阳性克隆;构建pGEX-4T-sCD40L重组质粒,经转化和筛选获得重组菌,经酶切、基因测序证实序列正确。结论成功构建pGEX-4T-sCD40L原核表达载体,为进一步探讨sCD40L在肝癌诊断中的作用奠定基础。