不同年龄正常人外周血淋巴细胞端粒酶催化亚单位的表达

目的:探讨不同年龄正常人外周血淋巴细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)的表达规律。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及凝胶成像技术,检测105例20岁以上不同年龄正常人外周血淋巴细胞的hTERT表达的相对水平。结果:hTERT表达的相对水平在各年龄组分别为:20～29岁,0.557±0.190;30～39岁,0.600±0.360;40～49岁,0.723±0.206;50～59岁,0.498±0.213;60～69岁,0.626±0.203;70～79岁,0.524±0.340;≥80岁,0.702±0.214;各组间差异无显著性(P>0.05)。结论:正常人外周血淋巴细胞中端粒酶催化亚单位水平与年龄无明显相关性,提示端粒酶调控可能既有转录水平也存在转录后因素。     

端粒酶与端粒酶催化亚单位在乳腺肿瘤组织中的表达及其意义

目的探讨端粒酶活性与端粒酶催化亚单位（hTERT）在乳腺肿瘤组织中的表达及其意义。方法采用银染-聚合酶链反应-酶免法（TRAP-PCR—ELISA）法检测48例乳腺癌组织标本、48例相应癌旁组织标本、19例良性乳腺肿瘤组织标本、21例正常乳腺组织标本的端粒酶活性，应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测hTERT的基因表达。结果端粒酶活性表达率和端粒酶催化亚单位hTERT基因表达率分别为：乳腺癌组为85．42％和89．58％；良性乳腺肿瘤组为42．11％和31．58％；相应癌旁组为14．58％和16．67％；正常乳腺组为0．00％，0．48％。乳腺癌组、良性乳腺肿瘤组、相应癌旁组及正常乳腺组之间均有非常显著性差异（P均〈0．001）；乳腺癌组端粒酶和端粒酶催化亚单位hTERT基因表达率与良性乳腺肿瘤组呈正相关（r分别为0．7982、0．6875，P均〈0．01）。结论端粒酶活性及其催化亚单位hTERT基因表达与乳腺肿瘤的形成和发展过程有关；端粒酶活性和端粒酶催化亚单位基因表达的检测，可作为乳腺肿瘤诊断、治疗、监测、预后的重要指标，具有较重要的价值。     

原代白血病细胞人端粒酶催化亚单位的表达

目的 :研究原代白血病细胞人端粒酶催化亚单位 (hEST)的表达及其临床意义。方法 :应用RT -PCR方法检测 30例初发急性白血病 (AL)患者、1 2例AL获完全缓解 (CR)患者和 6例正常志愿者骨髓单个核细胞 (MNCs)hESTmRNA的表达。结果 :初发AL患者骨髓MNCshESTmRNA表达量 (0 .71± 0 .34)明显高于CR患者 (0 .4 3± 0 .2 5 ,P <0 .0 5 )及正常志愿者 (0 .2 2± 0 .2 1 ,P <0 .0 1 )。初发AL患者骨髓常规涂片中原始细胞百分率与骨髓MNCs的hESTmRNA表达量呈正相关 (r =0 .4 5 7,P <0 .0 5 )。结论 :初发AL患者骨髓MNCs的hESTmRNA表达增高。hESTmRNA表达可能代表白血病细胞的一种高增殖状态     

植物凝集素刺激下人外周血淋巴细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)表达上调

目的通过测定正常人外周血淋巴细胞中hTERT在植物凝聚素(PHA)刺激前后的表达水平的变化,评估正常人淋巴细胞对PHA刺激的反应能力。方法采集40例正常人外周血,分离淋巴细胞后,一部分在含0.5%PHA的培养液中培养,分别于24h、48h收集细胞,提取总RNA后,用RT-PCR法测定其hTERT合成水平的相对含量。结果淋巴细胞受到PHA刺激前hTERT的表达相对水平为0.575±0.231。刺激后24h、48hhTERT的表达相对水平分别为0.723±0.294,0.931±0.342,刺激后较刺激前明显升高(P<0.01)。结论正常人外周淋巴细胞活化时,hTERT的表达水平随时间延长明显升高。     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究

目的 研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果.方法 ①用已构建的hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;②MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;③将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用.结果 ①转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;②GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK 和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照, 转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;③pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%).结论 hTERT启动子可以调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向性表达,HSV-TK/GCV治疗系统在hTERT启动子调控下对肺癌细胞A549的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用.     

端粒酶及蛋白亚单位在骨巨细胞瘤中的表达

[目的]检测人端粒酶活性和端粒酶蛋白亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因在不同分级骨巨细胞瘤组织中的表达情况.[方法]收集骨巨细胞瘤样本并进行病理学分级,采用TRAP方法检测端粒酶活性,RT-PCR方法检测各样本中hTERT基因的表达,经薄层分析扫描进行定量分析.[结果]约80%的骨巨细胞瘤组织中有端粒酶活性表达,与表达组织学分级差异无统计学意义(P＞0.05).4例骨巨细胞瘤Ⅰ级样本不表达hTERT基因或表达极弱,13例骨巨细胞瘤Ⅱ级与3例骨巨细胞瘤Ⅲ级的样本有较高的hTERT基因表达水平,与骨巨细胞瘤Ⅰ级的表达差异有统计学意义(P＜0.05),骨巨细胞瘤Ⅱ级与Ⅲ级的hTERT表达差异无统计学意义(P＞0.05).术后复发样本hTERT基因表达亦较其他样本明显增高.[结论]骨巨细胞瘤组织中可检测到端粒酶活性和hTERT基因,hTERT基因表达量可为骨巨细胞瘤分级及生物学行为的预测提供参考.     

人胰腺癌端粒酶亚单位的表达及其意义

目的：探讨端粒酶亚单位表达水平与人胰腺癌发生的关系，以及表达与端粒酶活性高低的相关性。方法：应用RT－PCR，DNA测序等技术研究端粒酶亚单位在胰腺癌中的表达情况，用ELISA法检测端粒酶活性。结果：24例胰腺癌标本中hTERT mRNA表达阳性率为83．3％，而癌旁组织为8．3％，两者有显著性差异。hTERT mRNA的表达是人端粒酶活性表达的关键性因素。hTR入TP1 mRNA在癌组织及癌旁组织中的表达无统计学差异，与端粒酶活性的表达无相关性。结论：端粒酶参与了胰腺癌的发生；hTERT mRNA表达水平的上调可能在胰腺癌形成过程中起重要作用。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

胃癌前病变组织中人端粒酶催化亚单位的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系

目的:探讨胃癌前病变组织中人端粒酶催化亚单位(hTERT)的表达状况及其与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系.方法:采用实时定量荧光RT-PCR方法检测胃黏膜中hTERT表达水平,将hTERT与GAPDH拷贝数之比的100倍作为标准化hTERT(NhTERT),用快速尿素酶法和Warthin-Starry银染色法检测Hp.结果:伴肠上皮化生的萎缩性胃炎组织中hTERT表达明显增高(80.9±6.36),而肠上皮化生的Hp感染率明显高于无肠上皮化生者(69%vs31%),Hp阳性患者hTERT表达水平为(101.5±13.50),Hp阴性患者hTERT表达水平为(49.6±8.58),二者相比有统计学意义(P＜0.01).结论:在胃癌前病变阶段,Hp感染与端粒酶表达水平之间有直接关系,呈正相关,提示端粒酶、Hp感染在胃癌的发生、发展中起重要作用.     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

三氧化二砷对Hela细胞hTERTmRNA表达的调节和对端粒酶活性的影响

目的：观察三氧化二砷(As2O3)对人宫颈癌细胞(Hela细胞)端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(hTERTmRNA)表达的影响。方法：以2μmoL／L的As2O3作用于人宫颈癌Hela细胞，在不同时间点用MTT法检测Hela细胞活力的变化，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，用RT-PCR法检测hTERTmRNA表达的变化，用TRAP-ELISA法检测端粒酶活性的变化。结果：随着As2O3作用时间的延长，Hela细胞的活力逐渐降低，G0／G1期细胞所占比例升高，S期细胞所占比例减少，hTERTmRNA表达水平逐渐降低，端粒酶活性逐渐下降。结论：As2O3可引起Hela细胞周期阻滞，hTERTmRNA的表达水平下调，端粒酶活性降低。     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

妊娠滋养细胞疾病组织中端粒酶逆转录酶表达的研究

目的探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)在妊娠滋养细胞疾病中的表达及其临床意义。方法采用兔抗人端粒酶逆转录酶抗体,利用免疫组织化学方法检测29例妊娠滋养细胞肿瘤、18例葡萄胎和20例正常早孕绒毛组织中hTERT的表达,结合Leica Qwin图像分析系统对hTERT阳性细胞进行灰度分析。结果hTERT表达定位于细胞质。hTERT阳性细胞平均灰度值在妊娠滋养细胞肿瘤、葡萄胎和正常早孕绒毛组织中分别为123.31±11.93、99.00±11.21和102.55±16.35。hTERT在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达明显高于葡萄胎和早孕绒毛组织,差异有显著性(P<0.01)。结论端粒酶的活化在妊娠滋养细胞肿瘤形成中可能起重要作用,端粒酶活性的检测可能是预测葡萄胎预后的重要指标。     

膀胱移行细胞癌中端粒酶逆转录酶的表达及意义

目的　研究端粒酶逆转录酶 (hTRT)在膀胱移行细胞癌BTCC中的表达及其与肿瘤分级、分期、复发之间的关系。方法　采用原位核酸分子杂交法 ,对 5 2例BTCC和 10例正常膀胱中hTRT的表达情况进行检测 ,分析其在膀胱癌和非癌膀胱组织中的表达以及与肿瘤病理学分级、分期和患者复发情况的关系。结果　 5 2例BTCC中hTRT表达均较正常膀胱黏膜增高 ,阳性率为 90 4 % (P <0 0 0 1) ;hTRT的表达随BTCC的病理分级、分期的增高而相应增高 ,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中表达率分别为 80 0 %、95 8%、10 0 % ,浅表性 (Tis T1 )、浸润性 (T2 T4 )中表达率分别为 87 0 %、93 1% ,初发BTCC、复发BTCC表达率为 87 5 %、95 0 % (P<0 0 5 ) ;结论　人端粒酶逆转录酶 (hTRT)在BTCC中表达上调 ,提示hTRT可能通过激活端粒酶 ,使细胞无限增殖 ,对BTCC的发生发展起重要作用 ;hTRT随BTCC病理分级、分期增高而表达增高 ,并与肿瘤复发有关 ,hTRT有可能作为判断分级、分期 ,监测复发的指标 ;hTRT可能为膀胱癌基因治疗提供新的合理靶点。     

人胎肺发育不同阶段端粒酶逆转录酶的表达及意义

目的 检测端粒酶逆转录酶(hTERT)在人胎肺发育不同阶段的表达特征,探讨其在胎肺上皮干细胞发育、分化过程中的作用及意义。方法 对孕妇自愿捐献的胎龄为10~34周的引产胎儿肺组织,用免疫组织化学技术检测hTERT的表达。结果 胎龄10周的肺组织即检测到hTERT的表达,主要表达于正在分支的支气管原始上皮细胞浆内。随着胎肺发育,阳性表达的细胞逐渐向远端呼吸道迁移。到发育晚期,呼吸道上皮hTERT表达较前逐渐减弱,强阳性表达的细胞仅集中在细支气管的基底膜和少数新生肺泡内,在形态上类似基底细胞和Ⅱ型肺泡细胞。结论 在人胎肺发育中hTERT的表达可能是肺上皮干细胞或祖细胞维系其未分化状态和自我更新能力的重要标志;对保证支气管上皮和肺泡上皮细胞持续正常分化和再生,维持上皮组织的完整性起着重要的作用。     

地高辛标记的寡核苷酸探针两步原位杂交检测胸液细胞hTERT mRNA

目的 建立原位杂交法检测胸液细胞中人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的实验方法,初步评价该法识别胸液中肿瘤细胞的效果。方法 取23例胸腔积液病例标本,以地高辛标记的寡核苷酸探针对胸液细胞hTERT mRNA行两步原位杂交,再通过抗原-抗体-酶-显色途径,测出hTERT mRNA信号。实验研究设严格的阴性、阳性对照,且与临床诊疗各自独立进行。结果 本法对9例恶性胸腔积液病例检测的结果均为阳性,即无论细胞形态是否异常,镜下均可见到有细胞质深染及部分细胞核少许点状着色的细胞。此9例中,7例经胸液细胞形态学检查亦示阳性者,可同时观察到形态明显异常的肿瘤细胞,其余2例经反复胸液细胞形态学检查阴性,但胸膜活检确诊为恶性胸腔积液者,虽未见到形态明显异常细胞,但镜下可发现胞质深染、部分细胞核少许着色的细胞。14例良性胸腔积液病例的检测结果均为阴性。结论 原位杂交法检测胸液细胞hTERT mRNA可望作为一种临床细胞病理学的新方法,用以鉴别胸腔积液的良、恶性,同时判定肿瘤细胞的类型。