过表达大鼠TIPE2基因重组腺病毒载体的构建

背景：TIPE2抗炎蛋白,通过对T细胞受体（TCR）和T细胞TOLL样受体信号途径实行负向调节,从而对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用,有效地维持机体内环境的稳定。目的：使用人工合成腺病毒载体构建能过表达大鼠TIPE2基因的重组腺病毒。方法：利用RT-PCR的方法,从大鼠淋巴细胞中扩增出大鼠TIPE2基因,克隆到穿梭质粒pShuttle-clontech的表达框中,然后将包含TIPE2的完整表达框,进一步亚克隆到黑猩猩来源的腺病毒包装载体AdC68,转染HEK 293A细胞,包装出重组腺病毒。并以其感染HEK293A细胞,采用western blotting方法检测TIPE2基因的表达水平。结果与结论：PCR扩增、酶切鉴定和测序结果表明,所获取的cDNA为TIPE2的蛋白编码基因,western blotting结果表明,重组腺病毒能可高效表达TIPE2基因。说明成功完成AdC68-TIPE2重组腺病毒的构建,该腺病毒载体,能稳定表达大鼠TIPE2基因。     

关于阿尔茨海默病的机制研究: Mint2基因在 PC12细胞中的表达功能及其作用的初步研究

目的获得高表达 Mint2蛋白的 PC12稳定表达株,观察 Mint2蛋白对 PC12细胞形态的影响,深入研究阿尔茨海默病的发病机制. 方法用 PCR方法将 Mint2基因亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1A,构建真核表达载体 pcDNA3.1-AMint2;采用脂质体 lipofectamine2000介导,将重组载体转染入 PC12细胞, G418筛选稳定克隆;用 RT-PCR和 Westernblot检测外源基因 Mint2在 PC12细胞中的转录及表达,并观察 Mint2蛋白对 PC12细胞形态的影响. 结果成功构建了真核表达载体 pcDNA3.1-Mint2;并获得了稳定表达 Mint2蛋白的 PC12- Mint2基因工程细胞株; Mint2对 PC12细胞具有明显的促分化和促胞体增大的神经营养作用. 结论Mint2可在 PC12细胞中有效表达,目对 PC12细胞形态有明显影响,这为进一步研究 Mint2生物学功能及其作用机制奠定了基础.     

水飞蓟素在去血清条件下诱导G0／G1期人宫颈癌HeLa细胞凋亡

背景：宫颈癌是危害女性身体健康，降低生活质量的疾病之一。利用中药治疗宫颈癌，降低放射治疗、应用抗肿瘤药物治疗副作用对机体伤害已成为医药界的研究热点在欧洲，水飞蓟素曾广泛用于临床的肝炎治疗。它毒性小，在植物中含量高。因此，一些学者正在研究其抗肿瘤的活性。目的：探讨水飞蓟素对人子宫颈癌细胞的药理作用机制。设计：以体外10％血清正常培养的细胞作为阴性对照的实验对照研究。单位：沈阳药科大学中日医药研究所，昭和药科大学病态科学教研室。材料：人的宫预癌HeLa细胞为本实验室保存的美国ATCC细胞系实验于2003—01／07在沈阳药科大学中日医药研究所细胞室完成。方法：噻唑蓝还原法(MTT)分析HeLa细胞的死亡率。采用相差和荧光显微镜观察细胞形态学改变。用流式细胞术分析了细胞周期的变化。主要观察指标：细胞死亡率和细胞周期分化的变化。结果：水飞蓟素诱导的HeLa细胞死亡与培养液中血清含量有关。给予80μmol／L的水飞蓟素作用．去血清组的细胞死亡率达到85.27％．含5％．10％血清组的死亡率为35．53％，7.71％细胞的形态学变化表明水飞蓟素诱导的HeLa细胞发生凋亡流式细胞分析结果显示：水飞蓟素诱导70.04％的细胞发生凋亡，这些凋亡细胞主要来自G0／G1期。结论：水飞蓟素在去血清条件下．诱导处G0／G1期的HeLa细胞发生凋亡。     

石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞生长曲线及周期的影响

背景:有报道指出石墨碳纳米颗粒具有强大的吸附能力,只要尽可能将其控制在有效浓度范围内,石墨碳纳米颗粒会具有很好的细胞相容性、增敏效应.目的:观察石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞的生长增殖、细胞周期及凋亡的影响.设计、时间及地点:细胞-材料学体外实验,于2007-01/2008-12在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成.材料:石墨碳纳米颗粒由中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心自制.人肝细胞(L02)、人肝细胞(H17702)、小鼠细胞(3T3)、人肝癌细胞(HepG2)购自湘雅医院中心实验室公司.方法:取石墨碳纳米颗粒母液,稀释10倍后,采用激光粒度分析仪观察石墨碳纳米颗粒的大小及Zeta电位.取含胎牛血清的RPMI-1640培养基,设立11瓶,分别加入适量石墨碳纳米颗粒母液,使其含石墨碳纳米颗粒的浓度分别为100,75,50,25,20,15,12.5,10,7.5,5,0 mg/L.将L02细胞、H17702细胞、3T3细胞、HepG2细胞密度均调整为1×109L-1,接种后置37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中,取处于指数生长期的细胞用于各项指标测定.主要观察指标:MTT比色法测定细胞数量,流式细胞仪检测细胞周期,计算细胞凋亡率.结果:石墨碳纳米颗粒的粒径约20 nm,带有负电荷,其电位值为-14.8 mV.与未加石墨碳纳米颗粒的空白对照组比较,除人肝癌细胞(HepG2)外,不同浓度的石墨碳纳米颗粒对其余3株细胞增殖均有促进作用,且浓度为7.5 mg/L时促细胞增殖作用最强.在石墨碳纳米颗粒浓度为7.5 mg/L.条件下,4株细胞的凋亡率均明显低于空白对照组.石墨碳纳米颗粒作用24 h的L02肝细胞周期发生改变,G0期细胞数减少,更多的细胞进入到S期和G2期.结论:石墨碳纳米颗粒能进入体外培养细胞内,并对细胞生长、增殖产生促进作用,不诱导细胞凋亡,其作用强度与浓度有关.     

水飞蓟素在去血清条件下诱导G0/G1期人宫颈癌HeLa细胞凋亡

背景宫颈癌是危害女性身体健康,降低生活质量的疾病之一.利用中药治疗宫颈癌,降低放射治疗、应用抗肿瘤药物治疗副作用对机体伤害已成为医药界的研究热点.在欧洲,水飞蓟素曾广泛用于临床的肝炎治疗.它毒性小,在植物中含量高.因此,一些学者正在研究其抗肿瘤的活性.目的探讨水飞蓟素对人子宫颈癌细胞的药理作用机制.设计以体外10%血清正常培养的细胞作为阴性对照的实验对照研究.单位沈阳药科大学中日医药研究所,昭和药科大学病态科学教研室.材料人的宫颈癌HeLa细胞为本实验室保存的美国ATCC细胞系.实验于2003-02/07在沈阳药科大学中日医药研究所细胞室完成.方法噻唑蓝还原法(MTT)分析HeLa细胞的死亡率.采用相差和荧光显微镜观察细胞形态学改变.用流式细胞术分析了细胞周期的变化.主要观察指标细胞死亡率和细胞周期分化的变化.结果水飞蓟素诱导的HeLa细胞死亡与培养液中血清含量有关.给予80 μmol/L的水飞蓟素作用,去血清组的细胞死亡率达到85.27%,含5%,10%血清组的死亡率为35.53%,7.71%.细胞的形态学变化表明水飞蓟素诱导的HeLa细胞发生凋亡.流式细胞分析结果显示水飞蓟素诱导70.04%的细胞发生凋亡,这些凋亡细胞主要来自G0/G1期.结论水飞蓟素在去血清条件下,诱导处于G0/G1期的HeLa细胞发生凋亡.     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景将生物材料复合细胞因子基因,或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复.目的观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性.设计对照观察实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科.对象新生SD大鼠5只,雌雄不限.方法实验于2000-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成.通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导入大鼠成骨细胞,并以质粒pcDNA3转染细胞作为对照.转染24 h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况.采用G418筛选转染细胞2周,获得阳性细胞克隆,用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况.主要观察指标链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况.结果①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果24 h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒,对照组空载体转染细胞胞浆中则没有棕黄色颗粒,说明转基因细胞中转化生长因子β1 mRNA明显增高.②G418筛选转基因细胞组化检测G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β1表达.结论利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子,转染后瞬时和筛选2周后,均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达,说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性.     

Gax基因过表达对低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及周期的作用

目的:探讨生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因转染在低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中过表达及其对细胞增殖和周期的作用。方法:腺病毒介导Gax基因(adenovirus expressing Gax cDNA,Ad-Gax)转染体外培养的PASMCs。在常氧(21%O2)和低氧(2·5%O2)2、6、12、24和48h条件下,利用RT-PCR和免疫细胞化学法分别测定转染前后PASMCs中Gax mRNA和蛋白表达;用四唑盐(MTT)比色法和流式细胞术检测各组PASMCs增殖和周期。结果:RT-PCR和免疫细胞化学法证实Ad-Gax转染后PASMCs中Gax能稳定过表达;MTT比色试验结果显示,未转染组常氧和低氧2、6、12、24和48h时PASMCs吸光度值分别为0·38±0·02、0·44±0·11、0·48±0·05、0·59±0·07、0·67±0·03和0·75±0·18,低氧组比常氧组明显增加(P<0·05);而转染组各时相吸光度值分别为0·17±0·04、0·15±0·02、0·24±0·11、0·33±0·13、0·31±0·03和0·37±0·09,低氧组比未转染组同时相点组明显降低(P<0·05、0·01)。流式细胞仪检测结果表明,Ad-Gax转染对常氧条件下PASMCs的周期没有显著影响,但可使低氧处理后PASMCs的G0/G1比例较未转染组显著增高、S G2/M比例显著降低(P<0·01);结论:Gax基因过表达能够抑制低氧性PASMCs的增殖。     

脑缺血再灌注后皮质区和纹状体区细胞周期蛋白D1和周期蛋白依赖性蛋白激酶4基因表达对神经细胞凋亡的影响(英文)

背景:脑缺血再灌注后细胞周期蛋白的表达以其在凋亡机制中的作用为主,部分细胞凋亡是由于细胞增殖周期的异常调控所致。目的:研究脑缺血再灌注后细胞周期蛋白D1(cyclinD1)和周期蛋白依赖性蛋白激酶4(cyclindependentkinase,CDK4)基因表达及其与神经细胞凋亡的关系。设计:随机对照的实验研究。地点和材料:本实验在青岛大学医学院脑血管病研究所和山东省脑血管病防治重点实验室完成。成年健康雌性SD大鼠36只,体质量230～270g,清洁级,由中国科学院上海实验动物中心提供。将动物随机分为假手术组4只和实验组32只,实验组再进一步分为缺血1.5h再灌注2,6,12h,1,2,3,7和14d亚组,每组4只。方法:全部实验均由本文作者完成。具体方法:应用线栓法经左侧颈外-内动脉插线建立SD大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型,原位末端标记法检测脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的变化,原位杂交技术检测cyclinD1mRNA和CDK4mRNA的表达。结果:脑缺血再灌注2h脑组织即开始出现凋亡神经细胞,并于1d和2d分别在皮质区和纹状体区达高峰(分别为72.80±4.66和96.75±4.37)。神经细胞cyclinD1mRNA和CDK4mRNA的表达分别于再灌注2h和6h开始逐渐增强,并于12h和1d分别在皮质区和纹状体区达高峰(皮质区分别为94.50±2.75和85.75±3.73,纹状体区分别为88.25     

WISp39基因对U937细胞增殖、凋亡和周期的影响

为了探讨一种新发现的p21调控蛋白WISp39对白血病细胞的增殖、凋亡和周期的影响,构建了WISp39的真核表达质粒pLenti6/V5-WISp39,并导入了人髓系白血病细胞系U937细胞,转染后用定量PCR检测了WISp39表达的变化,用CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术（FACS）检测细胞凋亡和周期的变化。结果显示：pLen-ti6/V5-WISp39转染48小时后,实验组中WISp39mRNA表达上升了（5.5±1.2）倍,同时U937细胞的增殖明显受到抑制,抑制率为37.6%;进一步的分析表明,在实验时间内,WISp39表达的升高不能明显诱导U937细胞的凋亡,但G0/G1期细胞比例由（40.59±0.7）%上升到（49.79±1.1）%。结论：WISp39对于U937无明显的诱导凋亡作用,但通过对细胞周期的影响,使停滞在G/G期的细胞增多,从而抑制了U937增殖。     

PLK1基因沉默对K562/A02细胞周期、增殖和耐药性的影响

为了探讨小干扰RNA(siRNA)对K562/A02细胞Polo样激酶1(PLK1)基因的抑制作用及其对细胞周期、细胞增殖和耐药性的影响,将构建的针对PLK1mRNA的siRNA真核质粒,导入K562/A02细胞,用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在转染前后的表达差异;台盼蓝拒染试验检测细胞存活率;流式细胞术(FACS)检测细胞周期和细胞内阿霉素(ADM)的积累量;MTT试验检测细胞对ADM的药物敏感性。结果显示,与对照组相比,转染24和48小时后,siRNA-PLK1质粒转染组的PLK1mRNA下降(34.7±2.1)%和(56.6±1.5)%,蛋白水平下降(49.9±3.2)%和(62.1±1.7)%;转染24和48小时后,细胞存活率下降了30%和59%;转染48小时后,G2/M期细胞比例提高了2.77倍,同时细胞内ADM积累量显著提高;对ADM药物敏感性的相对率为73.8%。结论:PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02细胞生长,使细胞周期停滞在G2/M期,同时使得细胞内ADM积累量提高,对ADM敏感性增强。     

RNA干扰沉默CXCR4基因对Jurkat细胞周期和凋亡的影响

本文研究探讨下调CXCR4的表达对人T-ALL Jurkat细胞周期和凋亡的影响。设计合成CXCR4的特异性siRNA,采用脂质体转染Jurkat细胞株。用RT—PCR检测siRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响,用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况。结果表明：成功构建了CXCR4的特异性siRNA;与空白对照组相比,转染CXCR4siRNA的Jurkat细胞的CXCR4mRNA表达水平明显下降（56．9％±1．4％FS68．3％±2．4％）,G0／G1期细胞比例增加（35．8％±1．9％vs18．1％±1．2％）,G,／M期和S期细胞比例相应下降（19．8％±1．7％VS27．2％±1．5％;44．4％±2．1％VS54．7％±2．8％）,凋亡细胞率明显增高（20．9％±2．0％VS3．13％±0．9％）。结论：CXCR4的特异性siRNA能够有效下调CXCR4基因表达,诱导Jurkat细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖。     

间充质干细胞对小鼠辐射早期造血组织细胞的细胞周期及凋亡的影响

本研究探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对急性放射病小鼠重要造血免疫器官的早期辐射防护作用及其机制。BALB/c小鼠受5.5Gy60Coγ射线照射后随机分为两组。MSC组照射后1小时内,经尾静脉输注BALB/c小鼠的MSC2.5×107/kg;对照组在照射后输注等体积生理盐水。用流式细胞术检测两组小鼠照射后6、12、24和72小时的骨髓、胸腺和脾细胞的凋亡及细胞周期变化;用免疫组织化学法检测照射后12小时胸腺和脾脏P53蛋白表达情况。结果显示:照射后6小时各器官细胞出现G0/G1及G2/M期阻滞,S期下降。胸腺细胞,脾细胞和骨髓细胞分别于照射后12、6和24小时后发现G0/G1期阻滞峰值,随后G0/G1期细胞减少,S和G2/M期细胞增多,72小时时G0/G1期细胞数低于正常值,S期细胞数高于正常值。胸腺和脾细胞周期改变快于骨髓细胞,改变幅度也大于骨髓细胞。MSC组细胞周期变化速度和程度高于对照组。流式细胞术显示各器官细胞照射后6小时凋亡率明显增加,12小时达高峰,24小时后逐渐降到正常,脾与胸腺细胞凋亡率高于骨髓细胞。MSC组的胸腺细胞照射后12小时、脾细胞照射后12、24小时、骨髓细胞照射后24小时的凋亡率均少于对照组。免疫组织化学检测显示,照射后12小时MSC组小鼠脾脏胸腺细胞P53蛋白表达低于对照组。结论:MSC加快辐射小鼠骨髓、胸腺和脾脏细胞的周期变化,减少细胞凋亡,促进受损的造血和免疫器官修复,从而对受照小鼠起到早期辐射保护作用。     

转染p16与dll4阻滞白血病细胞株K562细胞周期

本研究探讨p16,dll4基因真核表达载体在白血病细胞中的表达和作用,设计并构建包含野生型p16cDNA,dll4cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-16-dll4,用脂质体法转染白血病细胞,用Western blot方法检测外源性p16及dll4的表达情况;通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞的生长曲线和周期。结果表明:成功构建p16、dll4基因双表达真核载体,体外成功转染入白血病细胞。在白血病细胞检测到外源性P16、Dll4蛋白的表达。转染48小时后,试验组与对照组比较,细胞周期被阻滞(p0.001),细胞增殖下降(p0.001)。结论:重组质粒pBudCE4.1-16-dll4体外转染白血病细胞后,两个目的基因能够在细胞中同时表达,并诱发细胞周期阻滞于G0/G1期。     

外源性线粒体融合素基因-2转染对肝癌细胞体外生物学行为的影响

目的 研究外源性线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene，mfn2)对肝癌细胞株HepG2体外生物学行为的影响。 方法 基因重组构建并鉴定mfn2真核表达质粒pEGFPmfn2，用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应检测转染后细胞mfn2 mRNA的表达水平；Western-blot检测线粒体融合蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测mfn2对HepG2细胞增殖的影响，Annnexin-V/PI双标流式细胞术检测转染细胞凋亡的变化。结果 重组真核表达质粒pEGFPmfn2经限制性内切酶双酶切，电泳后显示约约2.3kp的mfn2片段和4.7kb的pEGFP-N2¬载体片段。RT-PCR及Western-blot显示转染组有mfn2基因mRNA及其蛋白表达。MTT实验提示转染mfn2基因后，HepG2细胞增殖受到抑制；流式细胞分析显示转染组与转染空质粒组和空白对照组相比可促进细胞凋亡。结论 成功构建了pEGFPmfn2真核表达质粒，外源性mfn2基因可抑制肝癌细胞的增殖，并可诱导肝癌细胞凋亡。     

六亚甲基二乙酰胺对HL-60细胞细胞周期及其调节蛋白表达的影响

六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisecetamide,HMBA)是一种极性诱导分化剂，已应用于临床治疗急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征(MDS)，但其诱导髓系白血病细胞分化的机制尚不清楚。本研究观察了HMBA对HL—60白血病细胞细胞周期及其调节蛋白表达的影响，以探讨其药理机制。用流式细胞术检测HMBA对HL—60细胞细胞周期分布和细胞周期蛋白D、E及p27表达的影响。用RT—PCR研究HMBA对细胞周期负性调控分子CKI p15，p16，p27基因mRNA表达的影响。结果表明，HMBA主要使HL—60细胞阻滞于G0/G1期，经HMBA处理后HL-60细胞胞浆内细胞周期蛋白E蛋白表达显降低，而细胞周期蛋白D和p27蛋白表达则显增高；未经HMBA处理的HL-60细胞p15，p16 mRNA均无表达；3mmol／L HMBA处理24小时后p15 mRNA出现弱阳性条带，48小时和72小时后出现强阳性条带，p16 mRNA则在48小时后出现弱阳性条带，72小时后出现强阳性条带；p27 mRNA在未经处理和处理后24，48和72小时后均出现强阳性条带，阳性程度无明显差异。结论：HMBA的药理机制之一可能是通过下调细胞周期蛋白E，上调p27蛋白的表达，同时使得p15，p16基因mRNA重获表达。阻滞HL—60细胞周期于G1期，从而发挥其抗增殖作用。     

TLR2配体肽聚糖对骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响

本研究探讨不同剂量的Toll样受体2（TLR2）的配体肽聚糖（peptidoglycan,PGN）在体外对人骨髓间充质干细胞（BM—MSC）增殖和细胞周期的影响。采用Ficoll淋巴细胞分离液、密度梯度离心法分离BM—MSC,体外扩增,并通过流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度;将分离培养的BM—MSC按一定浓度接种于96孔板中,以1、10、20μg/ml的PGN与BM—MSC共培养为实验组,不加PGN的BM—MSC为对照组;培养第1至第7天,MTT法检测BM—MSC的增殖情况;以上述浓度的PGN与BM—MSC共培养72小时后,流式细胞术检测BM—MSC的细胞周期。结果表明,BM—MSC与PGN共培养后,BM—MSC的增殖指数明显增加,呈时间、剂量依赖性,以10μg／ml PGN促BMMSC增殖作用最明显。与对照组比较,PGN干预组G0／G1期细胞比例降低,S期和G2／M期细胞比例增加,以10μg／ml组最明显。结论：在培养条件下PGN可以促进更多的BM—MSC进入DNA合成期,从而有更多的细胞分裂,产生大量的增殖细胞,并且这种影响呈时间、剂量依赖性。     

Jurkat细胞转染外源HCAP1基因后的增殖抑制

HCAP1基因系人类染色体 17p13 .3区带克隆的新肝癌相关基因。已发现人类多种肿瘤存在此区带的杂合性缺失。本研究应用脂质体介导法将HCAP1基因转染T淋巴瘤Jurkat细胞系 ,经G418筛选 ,获得稳定表达外源HCAP1基因的细胞。用台盼蓝拒染试验计数活细胞 ,绘制生长曲线 ,进行软琼脂集落形成试验。结果显示 :与转染空载体质粒 pBK/CMV的细胞比较 ,转染外源HCAP1基因的Jurkat细胞增殖速率明显减慢 ,细胞倍增时间延长 ,在软琼脂上的集落形成能力下降 (P <0 .0 1)。结论 :外源HCAP1基因产物对Jurkat细胞的增殖有明显的抑制作用。     

WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究

为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA（-17AA/-KTS）全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6^＋转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论：增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由＋17AA/＋KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.     

SARI基因过表达对K562细胞系生物学影响的研究

目的:通过构建SARI慢病毒表达载体,探讨SARI基因过表达对K562细胞生物学功能的影响。方法:采用RT-PCR方法获得目的基因并重组p LOV.CMV.GFP质粒,构建pLOV.CMV.GFP-SARI表达载体。通过测序鉴定、病毒包装和滴度测定后,获得阳性病毒颗粒,并以病毒颗粒感染K562细胞系。采用Q-PCR及Western blot方法验证感染后K562细胞SARI基因转录和蛋白水平的表达情况,同时采用CCK-8法检测K562细胞的增殖情况,以流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期变化。结果:利用RT-PCR方法获得SARI基因并成功构建了含SARI基因的慢病毒表达载体,从分子及蛋白水平验证了其在感染后K562细胞中的高表达;与空白组和感染空载体的Mock组相比,过表达SARI载体组的细胞增殖显著受抑、细胞凋亡率增加,而细胞周期无显著变化。结论:SARI基因过表达可抑制K562细胞的增殖并促进其凋亡,提示诱导SARI基因过表达可能对于抑制CML发生发展具有重要的作用。