尾加压素Ⅱ通过ERK1/2途径诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和上调Egr-1表达

 目的:研究不同浓度尾加压素Ⅱ（UⅡ）及其受体拮抗剂urantide对培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖的影响,探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径及早期生长反应因子1（Egr-1）在UⅡ诱导大鼠PASMCs增殖中的作用。 方法: 以组织贴块法原代培养大鼠PASMCs：(1) 采用BrdU掺入实验测定不同浓度（1 μmol/L、0.1 μmol/L和0.01 μmol/L）UⅡ及其受体拮抗剂对大鼠PASMCs 增殖的影响;(2) 采用real-time PCR检测UⅡ及其受体拮抗剂对细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)、应激活化蛋白激酶（SAPK）、p38 MAPK及Egr-1 mRNA 表达的影响;(3) 采用Western blotting检测UⅡ、urantide及ERK1/2抑制剂PD98059对PASMCs磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、p-SAPK、p-p38 MAPK和Egr-1蛋白表达的影响。 结果: （1）UⅡ在一定浓度范围（1 μmol/L、0.1 μmol/L和0.01　μmol /L）呈浓度依赖性地促进肺动脉平滑肌细胞增殖(P＜0.01或P＜0.05),这种增殖作用可被urantide拮抗(P＜0.05);（2）UⅡ上调ERK1/2、SAPK及Egr-1 mRNA表达(P＜0.01或 P＜0.05),PD98059和(或)urantide可拮抗UⅡ诱导的ERK1/2、SAPK和Egr-1 mRNA的表达(P＜0.01或 P＜0.05),但对p-p38 MAPK无影响;（3）UⅡ可增加PASMCs p-ERK1/2、p-SAPK及Egr-1蛋白表达(P＜0.01或 P＜0.05),urantide及PD98059可拮抗UⅡ诱导的p-ERK1/2、p-SAPK和Egr-1蛋白表达(P＜0.01, P＜0.05)。 结论: UⅡ可能通过ERK1/2途径诱导PASMCs增殖和上调Egr-1表达,Egr-1可能通过激活ERK1/2途径参与了PASMCs的增殖。     

胰岛素对大鼠结肠平滑肌细胞凋亡及MAPK通路的影响

 目的 探讨胰岛素对大鼠结肠平滑肌细胞( SMCs )凋亡及丝裂原活化蛋白激酶( MAPK )信号转导通路的影响。方法 酶解法分离培养SD大鼠结肠SMCs,α-actin免疫鉴定,将大鼠结肠SMCs分为正常组,胰岛素组,胰岛素 +PD98059( ERK抑制剂)组,MTT法检测SMCs增殖,流式细胞术Annexin V-FITC/PI检测SMCs凋亡,Western blot法检测p-ERK、ERK、p-P38MAPK、P38MAPK和p-JNK、JNK表达。结果 胰岛素组较正常组细胞明显增殖,凋亡率降低,p-ERK表达增强,p-ERK/ERK 比值升高( 110.36 ± 9.5 vs 50.92 ± 6.01 ) ( P < 0.01 );p-P38MAPK、P38MAPK、p-JNK、JNK表达无差异。PD98059组较正常组细胞增殖明显下降,凋亡率升高,p-ERK表达减弱,p-ERK/ERK比值降低( 15.69 ± 2.11 vs 50.92±6.01 ) ( P < 0.01 )。结论 胰岛素可能通过激活结肠SMCs的MAPK通路中的ERK途径,促进细胞增殖,抑制凋亡,可能与P38MAPK途径和JNK途径无关。     

青蒿琥酯通过抑制ERK1/2蛋白活化负性调控HSC-T6细胞cyclin D1的表达和AP-1活性

目的: 通过观察青蒿琥酯(artesunate,Art)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的影响,探讨Art抗肝纤维化的分子机制。方法: 用血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)诱导HSC-T6细胞的增殖。实验分为对照组、PDGF-BB组、PDGF-BB+Art组(Art终浓度6.25 mg/L、25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+ERK抑制剂PD98059组。ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量,RT-PCR检测各组ERK1/2和cyclin D1 mRNA水平变化,Western blotting法检测各组p-ERK1/2和cyclin D1蛋白表达水平,凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测AP-1的活性。结果: (1)PDGF-BB 可明显促进HSC-T6细胞的增殖,PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059均可抑制HSC-T6细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量(P<0.05,P<0.01)。(2)PDGF-BB+Art组(50 mg/L)ERK1/2 mRNA的表达低于PDGF-BB组(P<0.05),其中PDGF-BB+PD98059组ERK1/2 mRNA的表达最低(P<0.01);PDGF-BB+Art组(25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+PD98059组cyclin D1 mRNA的表达明显低于PDGF-BB组(P<0.05,P<0.01)。(3)p-ERK1/2、cyclin D1蛋白表达水平在PDGF-BB组最高,而PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059组降低(P<0.05,P<0.01)。(4)Art可使AP-1与DNA结合活性下降。结论: Art可抑制HSC-T6细胞增殖,其机制可能与其抑制ERK1/2蛋白活化从而降低AP-1的活性和下调cyclin D1的表达有关。     

低氧诱导因子1在低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的: 探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和凋亡的影响,以及HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS蛋白表达变化在其中的作用与意义。方法: 体外培养大鼠PASMC，设计常氧组、低氧组及ADM、L-NAME、PD98059干预组，用MTT比色法和PCNA的免疫组化法测定细胞增殖反应，用流式细胞仪检测细胞凋亡，用Western blotting法检测HIF-1α、P-ERK1/2、iNOS的蛋白表达。结果: （1）低氧24 h组的A值明显高于常氧组(P<0.01)，而PD98059及ADM干预组明显低于低氧组(P<0.01)， L-NAME干预组明显高于低氧组和常氧组(P<0.01)。（2）免疫组化表明，低氧24 h组呈阳性表达(P<0.01)。PD98059、ADM抑制了PCNA的表达(P<0.01)， L-NAME促进了PCNA的表达(P<0.01)。（3）各组在低氧培养24 h后，凋亡指数差异无显著(均P＞0.05)。（4）Western blotting表明常氧组少量HIF-1α、iNOS、 P-ERK1/2表达，低氧4 h后均表达增高(P<0.01),8 h仍维持在高峰(P<0.01)，而HIF-1α、P-ERK1/2在低氧24 h后表达下调。L-NAME促进了HIF-1α表达(P<0.01),PD98059部分抑制了HIF-1α、iNOS及P-ERK1/2表达(P<0.01)；ADM部分抑制了HIF-1α表达，促进iNOS表达(P<0.01)。结论: 低氧能促进肺动脉平滑肌细胞增殖，对细胞的凋亡无影响；HIF-1在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖中起重要作用。     

ADM和ADT对肺动脉平滑肌细胞胶原合成及磷酸化ERK1/2表达的影响

目的: 检测不同浓度的肾上腺髓质素(ADM)和肾上腺加压素(ADT)对培养的Wistar大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)Ⅰ、Ⅲ型胶原合成和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)表达的影响,探讨PASMCs增殖过程中ERK途径是否被激活。方法: 取健康雄性Wistar大鼠,行大鼠远端PASMCs分离并进行原代培养,采用小鼠抗人平滑肌α-actin单克隆抗体对培养细胞进行鉴定;在培养基内分别加入10^-7 mol/L ADM或ADT培养72 h 后加入兔抗大鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体和兔抗大鼠p-ERK1/2抗体,0.01 mol/L PBS作阴性对照,FITC标记山羊抗兔IgG为Ⅱ抗,免疫荧光法观察PASMCs内Ⅰ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2表达。Western blotting检测10^-7mol/L、10^-8mol/L和10^-9 mol/L ADM或ADT对p-ERK1/2蛋白表达的影响。结果: 经平滑肌α-actin单克隆抗体对培养细胞进行鉴定,其纯度达97%。10^-7 mol/L ADM可抑制PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2的表达(P<0.05,P<0.01);10^-7 mol/L的ADT刺激后大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2的表达增强(P＜0.05,P<0.01)。Western blotting结果显示ADM可呈剂量依赖性抑制p-ERK1/2蛋白表达(P<0.01,P<0.05);而ADT也可呈剂量依赖性促进p-ERK1/2蛋白表达(P<0.01,P<0.05)。结论: ADM可抑制大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2表达,而ADT可促进PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2表达,提示PASMCs增殖过程中ERK通路被激活,ADM和ADT可能通过ERK1/2信号通路来调节PASMCs增殖。     

单核细胞趋化蛋白-1经细胞外信号调节激酶通路对肺癌A549细胞 增殖、侵袭转移的影响及机制*

目的：研究单核细胞趋化蛋白-1（ MCP-1）对非小细胞肺癌增殖、侵袭转移能力的影响及可能的作用 机制。方法：体外培养肺癌细胞株A549。细胞分为对照组,MCP-1 组（25、50、75、100 ng/mL）,MCP-1 （75 ng/mL）+PD98059 组（100 μmol/mL）,抑制剂PD98059 组（100 μmol/L）。MTT 法检测细胞增殖活力,细胞划痕、 Transwell 侵袭实验分析细胞迁移侵袭能力。免疫印迹检测细胞外信号调节激酶（ t-ERK）、磷酸化细胞外信号调 节激酶（ p-ERK）、基质金属蛋白酶-14（ MMP-14）、基质金属蛋白酶-2（ MMP-2）及N- 钙黏蛋白（ N-cadherin） 的表达。结果：与对照组相比,MCP-1 明显促进A549 细胞的增殖、侵袭与转移;免疫印迹结果显示,MCP-1 可 上调p-ERK、MMP-14、MMP-2 及N-cadherin 蛋白的表达;应用ERK抑制剂PD98059 可阻断上述作用。ERK总 蛋白表达量差异无统计学意义。结论：MCP-1 经ERK通路上调MMP-14、MMP-2 及N-cadherin 蛋白表达,促进 肺癌A549 细胞增殖、侵袭与转移。     

ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

缓激肽对TGF-β1诱导的猪肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

 目的：研究缓激肽（BK）对转化生长因子 β1（TGF-β1）诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响及其可能机制。方法：原代培养猪PASMCs,采用CCK-8法测定BK对TGF-β1诱导的PASMCs增殖能力的影响,同时应用Western blotting检测PASMCs PI3K、p-Akt和p-ERK1/2表达的变化。结果：TGF-β1呈剂量依赖性促进PASMCs增殖（P<005）,BK显著抑制了TGF-β1诱导的PASMCs增殖（P<005）,而BK 2型受体（B2R）抑制剂HOE-140可以显著抑制BK的效应（P<005）;Western blotting结果显示,BK抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖主要是通过阻断PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化而实现。结论：BK显著抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖,此作用可能与其抑制PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化有关。     

ERK1/2信号通路参与瘦素促人γδT细胞增殖调控

为探讨ERK1/2信号通路在瘦素促进人γδT细胞增殖中的作用机制。我们用MTT法观察不同浓度瘦素促γδT细胞的增殖效应,以及用ERK1/2特异性抑制剂PD98059阻断ERK1/2信号通路对瘦素促细胞增殖效应的影响,Western blot法检测瘦素干预对ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达水平的影响。结果显示,瘦素在一定浓度范围内促进人γδT细胞增殖。瘦素可使ERK1/2信号通路中的靶蛋白发生磷酸化激活,用PD98059阻断ERK1/2信号通路可显著抑制瘦素促细胞的增殖效应,亦可抑制瘦素对γδT细胞ERK1/2蛋白磷酸化。因此,我们认为瘦素促人γδT细胞增殖效应可能与激活ERK1/2信号通路有关。     

ERK信号通路参与调控周期性张应变诱导的人牙周膜细胞增殖

目的 探讨周期性张应变对人牙周膜细胞 （human periodontal ligament cell , hPDLCs ) 增殖的影响及其相关机制。方法 应用FX-4000T 细胞应变加载系统,对体外培养的人牙周膜细胞施加周期性张应变,幅度分别为10 % 和20 %,加载时间为6 h和24 h,频率均为0.1 Hz,以未加载的静态细胞作为对照组。Western blot 法检测细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞内信号转导分子p-ERK1/2表达的变化。用ERK1/2的特异性抑制剂PD 98059预处理细胞后,在0.1 Hz,10 % 幅度条件下,加载6 h,检测p-ERK1/2的表达水平变化对细胞PCNA表达的影响。 结果 与静态组相比,周期性张应变诱导人牙周膜细胞的PCNA和p-ERK1/2表达增加,10 % 幅度和20 % 幅度相比无显著性差异。同一幅度张应变,加载6 h和24 h对细胞PCNA和p-ERK1/2表达的影响无显著性差异。ERK1/2的抑制剂PD98059不仅可以明显抑制张应变诱导的p-ERK1/2 活化,而且张应变诱导的细胞PCNA表达也被明显抑制。结论 周期性张应变可激活ERK信号通路,促进体外培养人牙周膜细胞的增殖。     

Adrenomedullin and adrenotensin regulate collagen synthesis and proliferation in pulmonary arterial smooth muscle cells

To understand the pathophysiological mechanisms of pulmonary arterial smooth muscle cell (PASMC) proliferation and extracellular-matrix accumulation in the development of pulmonary hypertension and remodeling, this study determined the effects of different doses of adrenomedullin (ADM) and adrenotensin (ADT) on PASMC proliferation and collagen synthesis. The objective was to investigate whether extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) signaling was involved in ADM- and ADT-stimulated proliferation of PASMCs in 4-week-old male Wistar rats (body weight: 100-150 g, n=10). The proliferation of PASMCs was examined by 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation. A cell growth curve was generated by the Cell Counting Kit-8 method. Expression of collagen I, collagen III, and phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2) was evaluated by immunofluorescence. The effects of different concentrations of ADM and ADT on collagen I, collagen III, and p-ERK1/2 protein expression were determined by immunoblotting. We also investigated the effect of PD98059 inhibition on the expression of p-ERK1/2 protein by immunoblotting. ADM dose-dependently decreased cell proliferation, whereas ADT dose-dependently increased it; and ADM and ADT inhibited each other with respect to their effects on the proliferation of PASMCs. Consistent with these results, the expression of collagen I, collagen III, and p-ERK1/2 in rat PASMCs decreased after exposure to ADM but was upregulated after exposure to ADT. PD98059 significantly inhibited the downregulation by ADM and the upregulation by ADT of p-ERK1/2 expression. We conclude that ADM inhibited, and ADT stimulated, ERK1/2 signaling in rat PASMCs to regulate cell proliferation and collagen expression.     

H2 S抑制Ang II引起的神经元活性氧水平升高的机制研究

目的: 探讨硫化氢(H₂S)对血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)所致延髓神经元活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化的影响,以及H₂S抗氧化应激的相关机制。方法: 采用原代培养的延髓神经元,分组如下:对照组、Ang II处理组、硫氢化钠(NaHS)处理组、NaHS+Ang II处理组和PD98059(p-ERK1/2蛋白的抑制剂)+ Ang II处理组。选用二氢乙啶(DHE)荧光探针法测定各组神经元胞内的ROS水平,Western blotting检测ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表达量,CCK-8法测定神经元的活性。结果: Ang II(终浓度为100 nmol/L)引起神经元ROS水平升高;NaHS(50~200 μmol/L)明显抑制Ang II引起的神经元ROS水平升高,但单独给予NaHS并不影响神经元ROS水平;p-ERK1/2蛋白的抑制剂PD98059也能明显抑制Ang II引起的神经元ROS水平的升高;适宜作用浓度的NaHS能够显著降低Ang II引起的神经元p-ERK1/2蛋白表达。结论: H₂S能够显著抑制Ang II引起的神经元ROS水平升高,其作用机制与MAPK家族中p-ERK1/2蛋白的表达有关。H₂S可能通过降低p-ERK1/2的表达量而产生抗氧化应激作用。     

Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs增殖、凋亡的影响及与MAPK通路的关系

 目的：探讨电压依赖性钾离子通道Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖、凋亡的影响及其与丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路的关系。方法：体外培养大鼠PASMCs,复制低氧高二氧化碳模型,随机分组如下：常氧组（N组）;低氧高二氧化碳组（HH组）;低氧高二氧化碳+溶剂DMSO对照组（HD组）;低氧高二氧化碳+ERK1/2通路抑制剂U0126组（HU组）;低氧高二氧化碳+p38 MAPK通路抑制剂SB203580组（HS组）;低氧高二氧化碳+MAPK通路激动剂茴香霉素（anisomycin）组（HA组）。采用CCK-8法检测细胞活性,蛋白免疫印迹法检测Kv1.5、增殖细胞核抗原（PCNA）及Bax蛋白的表达水平。结果：与N组相比,HH组和HD组细胞活性增加（P<0.01）,PCNA蛋白表达上调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显降低（P<0.01）,HH组和HD组间各指标变化均无显著差异（均P>0.05）;较之HD组,HU组、HS组及HA组细胞活性降低（P<0.05或P<0.01）,PCNA蛋白表达下调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显增加,差异均显著（P<0.01）,其中以HA组各指标变化最明显。结论：钾离子通道Kv1.5对低氧高二氧化碳性大鼠PASMCs增殖、凋亡的调节可能与MAPK通路的激活有关。