丹参SmCYP76S7基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的 克隆获得丹参SmCYP76S7基因序列,并对其进行生物信息学和表达特性分析。方法 克隆获得SmCYP76S7 的cDNA及基因组DNA序列,运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析。构建融合表达载体pEGAD-SmCYP76S7-eGFP,转化烟草后分析SmCYP76S7蛋白的亚细胞定位。利用qRT-PCR测定SmCYP76S7基因在各器官中的表达量,同时分别利用不同光质和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）处理丹参幼苗和丹参毛状根,探究SmCYP76S7基因对光质和MeJA的响应。结果 SmCYP76S7基因包含2个外显子和1个1 506 bp的开放阅读框,编码501个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,其中花中表达量最低。SmCYP76S7蛋白除定位于内质网外,还分布于多个细胞结构。SmCYP76S7基因的表达在红光处理和MeJA处理样品中显著上调,是典型的光和MeJA诱导基因。结论 SmCYP76S7基因是CYP76家族成员,结合其表达特性和同家族其他成员的催化活性,该蛋白很可能参与丹参酮类成分的生物合成,其具体的生物学作用值得进一步深入挖掘。     

掌叶大黄RpNAC1基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

目的 克隆掌叶大黄Rheum palmatum转录因子基因RpNAC1,进行生物信息学、亚细胞定位及表达模式分析。方法 根据转录组中一个NAC unigene,利用RT-PCR克隆开放阅读框（open reading frame,ORF）。通过生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域等分子特征。采用DNAStar 6.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸序列比对和进化分析。构建绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体,以农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法分析亚细胞定位。运用qRT-PCR检测基因表达模式。结果 分离到RpNAC1基因,ORF（1269 bp）,编码一个由422个氨基酸组成的蛋白质,相对分子质量47 070,等电点5.80,包含一个保守NAC结构域（32～181）,与多种植物NAC蛋白一致性较高（62.42%～88.7%）,聚在植物NAC分子进化树的NAC2分支,与甜菜NAC（XP_010694507）亲缘关系较近。RpNAC1-GFP融合蛋白定位在烟草细胞核内。RpNAC1基因在一年生植株根中表达量最高,根茎中表达量最低,相对表达量分别为叶中的5.37、0.012倍;该基因响应200 μmol/L赤霉素（gibberellin,GA3）处理后在24 h内总体上调,200 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）处理1 h和12 h基因显著上调,200 μmol/L水杨酸（salicylic acid,SA）处理12 h显著诱导基因表达,200 μmol/L脱落酸（abscisic acid,ABA）处理抑制基因表达,200 μmol/L乙烯（ethylene,ET）处理未见明显变化。结论 获得掌叶大黄RpNAC1基因序列及表达特征,为进一步研究其在蒽醌类成分合成与积累中的转录调控作用提供支撑。     

丹参ERF转录因子SmERF1基因的表达分析和亚细胞定位

目的:对前期已经克隆的丹参SmERF1基因进行聚类分析,分析SmERFI基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况;并对其进行亚细胞定位分析.方法:利用MEGA5软件对SmERF1基因及拟南芥ERF基因家族进行聚类分析;利用半定量RT-PCR方法,分析SmERF1基因在不同诱导子处理后不同时间的表达情况;将SmERF1与GFP融合,在洋葱表皮瞬时表达,以确定SmERF1蛋白表达部位.结果:丹参SmERF1属于ERF家族第Ⅶ亚族;YE+ Ag+诱导对SmERF1基因的表达没有影响,ABA和MeJA可以抑制该基因的表达,而水杨酸诱导会出现先抑制,后随处理时间加长,SmERF1基因表达又恢复;亚细胞定位确定SmERFI基因在细胞核内特异表达.结论:SmE RF是一个AP2/ERF转录因子,属于AP2/ERF家族第Ⅶ亚族,其表达受ABA,SA,MeJA等激素调节控制.     

远志细胞色素P450家族PtCYP72A546克隆、亚细胞定位与表达分析

目的 旨在克隆获得远志Polygala tenuifolia 细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）基因CYP72A546的基因开放阅读框（open reading frame,ORF）,并对其理化特性、系统进化关系、组织表达、激素与非生物胁迫下的表达等展开分析。方法 基于远志全长转录组文库筛选并克隆远志细胞色素P450家族基因PtCYP72A546,通过生物信息学在线软件分析其编码的氨基酸序列,预测蛋白理化性质、结构域等分子特征;利用MEGA11分析进化关系,并采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测不同组织、激素及非生物胁迫的相对表达量。结果 从远志中成功克隆得到远志细胞色素P450家族基因PtCYP72A546,其ORF序列全长共计1 560 bp,编码519个氨基酸,相对分子质量为59 770,系疏水性稳定蛋白,含有1个保守结构域,不具有跨膜结构,二级结构主要为α-螺旋和无规卷曲,亚细胞定位分析表明PtCYP72A546-GFP融合蛋白定位于内质网。qPCR结果显示,远志根中CYP72A546表达量显著高于茎和叶片;200 μmol/L脱落酸（abscisic acid,ABA）和200 μmol/L壳聚糖（chitosan,CHT）处理下,CYP72A546均于12 h达峰值,分别为空白对照的7.45倍和5.49倍;在非生物（干旱、盐）胁迫处理下,CYP72A546的表达均先受抑制（6 h）,再上调后缓慢下降。结论 通过对远志CYP72A546基因的克隆、鉴定与分析,为深入研究其在远志三萜皂苷合成途径的功能奠定基础。     

丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析

目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎,在叶和花中有微量表达;茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.     

丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析。方法以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和c DNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列。运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用q RT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位。结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异。SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布。结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础。     

丹参转录因子SmWRKY14基因的克隆及表达分析

目的 克隆丹参Salvia miltiorrhiza转录因子基因SmWRKY14,分析其在不同组织及应答环境因子和植物激素过程中的表达特征。方法 以丹参转录组数据中Unigene（c50007_g1）序列为参考,利用PCR扩增获得SmWRKY14基因序列。通过生物信息软件及在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、蛋白质结构等分子特征,采用DNAMAN和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建,运用实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式。结果 克隆得到SmWRKY14基因cDNA全长1 103 bp,编码244个氨基酸,相对分子质量27 600,等电点8.19。该蛋白含有WRKY特征基序,不含信号肽及跨膜结构域,其高级结构主要由无规卷曲构成。进化树分析表明SmWRKY14蛋白与柿WRKY14蛋白的亲缘关系最近。SmWRKY14基因在丹参中各器官中为组成型表达,且该基因与丹参酮合成关键酶基因DXS、GGPPS、CPS的表达模式相似,且受茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素等植物激素及机械损伤的强烈诱导。结论 获得丹参SmWRKY14基因序列、生物信息及表达特征,为研究WRKY家族成员调控丹参酮类化合物的合成、应答植物激素及参与防御反应的分子机制提供理论依据。     

丹参SmNAC1基因的克隆和生物信息学分析

为了研究丹参中特有的NAC转录子在丹参生长发育、激素调节和抗逆胁迫应答调节中的功能,对丹参NAC转录因子进行了克隆和分析。根据丹参毛状根cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了丹参SmNAC1的cDNA全长序列。生物信息学分析显示基因的开放阅读框591 bp,编码166个氨基酸,相对分子质量21.66 kDa,等电点4.36 Genbank kF006346。SmNAC1蛋白的N-端具有保守的NAC_AB结构域,C-端高度变异。根据软件预测SmNAC1可能定位在细胞核。qRT-PCR分析YE+Ag⁺处理后SmNAC1在丹参毛状根中的表达变化,处理后2 h表达量上调至对照的1.5倍,4~12 h保持2倍的表达量,36 h时下降至对照水平以下,推测SmNAC1可能参与了丹参毛状根对YE+Ag⁺的胁迫应答调节。     

滇龙胆GrCYP450-17基因的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆幼叶中克隆萜类合成相关酶基因GrCYP450-17,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrCYP450-17基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrCYP450-17开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrCYP450-17,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 GrCYP450-17 ORF全长1 545 bp,编码514个氨基酸。序列分析表明,GrCYP450-17基因是CYP714家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrCYP450-17与番茄SlCYP450亲缘关系最近。构建pGEX-4T-1-GrCYP450-17重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrCYP450-17基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrCYP450-17蛋白、研究其结构和功能奠定基础。     

山茱萸CoHMGR基因的亚细胞定位和表达分析

目的 研究山茱萸Cornus officinalis CoHMGR基因编码蛋白质的亚细胞定位以及不同浓度的外源激素对CoHMGR基因表达和活性成分含量的影响。方法 农杆菌菌液侵染烟草叶片,激光共聚焦倒置显微镜观察CoHMGR蛋白的亚细胞定位。不同浓度的茉莉酸甲酯和乙烯利喷施山茱萸2年生幼苗,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定不同时期CoHMGR基因表达水平,高效液相色谱(HPLC)检测莫诺苷、马钱苷含量。结果 激光共聚焦显微镜下观察到CoHMGR蛋白定位于内质网中。qPCR和HPLC结果显示200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利对目的基因表达水平和活性成分含量都有正向诱导效应。结论 CoHMGR蛋白定位于内质网,外源喷施200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利能显著提高CoHMGR基因表达量和莫诺苷、马钱苷含量,为深入解析CoHMGR基因功能奠定基础。     

丹参NAC基因家族全基因组鉴定及表达研究

目的 基于基因组数据鉴定丹参NAC家族转录因子（SmNACs）基因,并对其进行生物信息学与表达模式分析,为进一步深入阐明其基因功能提供依据。方法 从丹参基因组数据库中鉴定出SmNACs基因,运用生物信息学方法及在线工具分析其结构特征,启动子顺式作用元件,编码蛋白的理化性质、亚细胞定位等,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定SmNACs基因在丹参受到茉莉酸甲酯（MeJA）胁迫时的表达模式。结果 从丹参的基因组中共确定了84个SmNACs基因（SmNAC01~SmNAC84）,不均等分布于8条染色体上,编码蛋白的氨基酸长度为120~794 aa,等电点为4.27~10.28;基因结构显示SmNACs基因基本都含有1~10个内含子;上游启动子含有与激素、逆境胁迫应激相关的ABRE、MBS、ARE、LTR、CGTCA-motif、TGACG-motif等顺式作用元件;构建丹参、南丹参与拟南芥的NAC家族成员的系统发育树,将84个SmNACs基因分为23个亚族。转录组数据显示SmNACs基因在丹参不同组织中差异表达,其中7个SmNACs基因在根中的表达水平较高;MeJA处理后,17个SmNACs基因表达水平明显上调,20个SmNACs基因表达水平明显下调。qRT-PCR表达分析发现,MeJA处理后,12个SmNACs基因的表达模式随着激素处理时间的增加呈现上调或下调的趋势,SmNAC09、SmNAC15、SmNAC16受MeJA诱导后48 h表达水平显著上调,SmNAC20、SmNAC77、SmNAC78受MeJA诱导表达水平下调。结论 研究结果为进一步解析SmNACs基因在丹参逆境响应及次生代谢产物生物合成中的调控机制提供了参考。     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定

目的 克隆与鉴定丹参Salvia miltiorrhiza鲨烯合酶基因。方法 基于丹参基因组的基因预测结果设计引物,通过RT-PCR方法,克隆丹参鲨烯合酶基因。利用生物信息软件对基因序列进行了结构分析,对基因编码多肽进行了序列同源性比较和保守结构域分析,利用实时定量RT-PCR方法对基因进行表达模式研究。结果 通过RT-PCR方法扩增得到2个丹参鲨烯合酶基因（SmSQS1和SmSQS2）,它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征,具有不同的组织特异性表达模式和时间表达模式。结论 丹参基因组中存在2个鲨烯合酶基因,它们具有不同的基因结构特征和表达模式,可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。     

垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

目的:从垂序商陆根中克隆了商陆皂苷甲生物合成过程中关键酶乙酰乙酰辅酶A转移酶(acetoacetyl-CoA transferase,AACT)基因,进行生物信息学分析和原核表达。方法:提取垂序商陆根的总RNA,然后逆转录合成c DNA,在分析垂序商陆转录组数据的基础上,设计Pa AACT基因的特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增Pa AACT基因的c DNA序列,通过构建原核表达载体p ET-32a-PaAACT,诱导表达并且纯化目的蛋白。结果:Pa AACT基因开放阅读框为1 254 bp,编码417个氨基酸。生物信息学分析显示Pa AACT蛋白的分子式为C1 914H3 120N538O576S17,推测其相对分子质量为43. 43 k Da,理论等电点8. 90,不稳定系数32. 27,属于稳定蛋白质。根据生物信息学分析结果,Pa AACT蛋白属于硫解酶家族成员,在C末端含有硫解酶家族的1个保守位点和1个活性位点。Pa AACT蛋白可能位于细胞质中、不含信号肽、没有跨膜区。系统进化分析显示Pa AACT蛋白与甜菜等廖科植物AACT蛋白亲缘关系较近。经IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21 (DE3)菌株中表达了Pa AACT重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱获得了纯化的目的蛋白。结论:该研究从垂序商陆中克隆Pa AACT基因,为下一步测定Pa AACT酶催化活性、制备抗体奠定基础,也为研究其在商陆皂苷甲生物合成途径中的作用提供理论依据。     

丹参SmCPS1基因启动子区甲基化特征分析及其与SmCPS1组织差异性表达的关系

目的:分析不同组织中丹参(Salvia miltiorrhiza)柯巴基焦磷酸合酶1基因(SmCPS1)启动子区甲基化分布特征及其与SmCPS1组织差异性表达的关系。方法:采用重亚硫酸盐转化法检测不同组织中SmCPS1启动子区-1 021 bp(转录起始位点+1)内的甲基化率;实时荧光定量聚合酶链式反应Real-time PCR检测不同组织中SmCPS1表达量。结果:SmCPS1启动子区甲基化主要集中在转录起始位点上游-750~-500 bp,-450 bp以内的启动子区几乎无甲基化。300个甲基化检测位点中,组织差异性甲基化位点共72个,占总检测甲基化位点数的24%;发生甲基化的转录因子结合区域共18个,其中有10个区域的甲基化存在组织差异。与SmCPS1表达量显著相关(P0.01)者21个,其中7个负相关者集中在-632~-450 bp,14个正相关者分布在-632 bp之外及-450 bp以内的启动子区。结论:SmCPS1启动子区甲基化差异可能是影响其组织差异性表达的原因。     

西洋参根腐病抗性相关基因PqDELLA1的克隆及表达分析

目的 克隆西洋参PqDELLA1基因,进行生物信息学分析,并探讨其在西洋参抗根腐病中的表达模式。方法 根据已获得的西洋参转录组数据,设计PqDELLA1基因全长扩增引物,利用无缝克隆的方法获得全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）;采用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线Blastp、DNAMAN和MEGA 6.0等软件对序列进行生物信息学分析;通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测PqDELLA1基因的组织表达及诱导表达模式。结果 扩增得到西洋参PqDELLA1基因,其cDNA序列为1743 bp,编码580个氨基酸;PqDELLA1蛋白相对分子质量为63 910,理论等电点为5.01,不含信号肽,为非跨膜蛋白,定位于细胞核,与番茄SlDELLA蛋白氨基酸相似度最高。qPCR结果显示PqDELLA1基因在叶中表达量最高,其次为茎,根中最少;该基因的表达受根腐病病原菌茄病镰刀菌（Fusarium solani）的诱导,接种后5 d内持续升高后降低。结论 首次克隆出西洋参PqDELLA1基因并进行了生物信息学和表达特性分析,发现该基因可响应F. solani的侵染,为后续解析其参与西洋参抗病反应的分子机制提供参考。     

丹参、生地黄中miRNA在人体血液中分离、鉴定及表达分析

目的:通过Northern印迹杂交(Northern blot)验证丹参、生地黄中微小核糖核酸(miRNA)的存在,及水煎服用后通过消化道可进人人体血液中.方法:根据已知丹参、生地黄miRNA序列设计合成10条(丹参4条,地黄6条)特异的LNA反义寡核苷酸探针,并用地高辛标记.在室温25℃条件下,用通用植物miRNA提取试剂盒和血液(液体样本)miRNA提取试剂盒,并按照试剂盒提供的操作步骤提取新鲜丹参、地黄以及服用丹参、生地黄水煎剂后人体血液的Total RNA,在变性条件下(15％的尿素变性)PAGE电泳分离小RNA,转膜、交联、杂交和检测.结果:Northern blot表明,丹参只有2种miRNA即miR156和miR157表达,生地黄miR5140,miR5139,miR 5138,miR 5137,miR 5142,miR 5141等6种miRNA均有表达.丹参处理组无miRNA表达,生地黄处理组中有miR5140,miR5137,miR5141等3种miRNA表达.结论:验证了丹参、生地黄中miRNA的存在,初步证明了生地黄经水煎后部分miRNA可通过消化道进入人体血液中,为研究miRNA在中药疗效的作用机制提供了新的思路和策略.     

白花前胡CAL基因的克隆和原核表达分析

目的 克隆得到白花前胡花发育关键基因CAULIFLOWER（CAL）并对其进行原核表达和基因表达分析。方法 根据白花前胡转录组数据中的基因序列信息,通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从白花前胡中克隆CAL基因,命名为PpCAL1和PpCAL2。构建原核表达载体pET-32a-PpCAL1和pET-32a-PpCAL2,并转化至大肠埃希菌Transetta（DE3）进行诱导表达。运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析抽薹开花前后白花前胡不同组织的基因相对表达量。结果 PpCAL1和PpCAL2的开放阅读框（ORF）长度分别为645、738 bp,分别编码214、245个氨基酸。结构功能域分析表明,PpCAL1和PpCAL2蛋白都具有MADS_MEF2_like和K-box保守结构域。原核表达结果显示,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷可成功诱导目的蛋白表达。系统进化树分析显示,白花前胡PpCAL1与胡萝卜DcCAL聚为一支,白花前胡PpCAL2与橡胶树HbCAL聚为一支。基因表达结果显示,PpCAL1和PpCAL2在不同组织中均在开花后表达量上调。结论 克隆并分析白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因,为进一步研究白花前胡开花基因提供参考。