乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制研究

目的:探讨乳痈方对4T1乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞表型变化的作用及机制。方法:①选用BALB/c小鼠,建立4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型。模型动物随机分为模型组、环磷酰胺(CTX,30 mg/kg)组和乳痈方低、中、高剂量(0.145,0.29,0.58 g/kg)组,每组4只。各组给予相应干预,连续20 d。末次给药后,采集小鼠胸腺、肺、脾、肿瘤、淋巴结组织,计算脏器指数和抑瘤率;观察肺表面结节情况,计算肺转移率。HE染色后光镜下观察胸腺形态学变化,免疫组化检测胸腺组织钙黏附蛋白E(E-cadherin)和波形纤维蛋白(Vimentin)的表达。②体外分离小鼠原代胸腺上皮细胞(TECs),通过转染SV40T基因构建永生化TECs(iTECs)并验证。采用不同浓度(0、25、50、100、200、400μg/ml)乳痈方提取液处理iTECs。细胞培养48 h后,MTT法检测细胞增殖率,结晶紫染色观察细胞增殖情况。将iTECs分为空白组、TGF-β_1组(10 ng/ml TGF-β_1)、乳痈方低剂量组(10 ng/ml TGF-β_1+50μg/ml提取液)、乳痈方中剂量组(10 ng/ml TGF-β_1+100μg/ml提取液)、乳痈方高剂量组(10 ng/ml TGF-β_1+200μg/ml提取液)。先加入TGF-β_1诱导48 h后,再给予相应浓度的乳痈方提取液干预24 h。免疫荧光和PCR检测细胞表型标志物E-cadherin、Vimentin、α-微管蛋白(α-tubulin)及相关转录因子Zeb 1、Snail 1的表达水平。建立Smad转染的iTECs,荧光素酶报告基因检测乳痈方对TGF-β_1诱导的转染iTECs细胞Smad通路活化的影响。结果:①与模型组相比,乳痈方低、中、高剂量组的肿瘤指数均显著降低(P0.05),抑瘤率分别为33.45%、31.43%和6.49%;肺转移总数以及直径2 mm转移灶数均明显减少(P0.05,P0.01),肺转移率分别为75%、75%和100%。HE染色观察显示,模型组小鼠胸腺组织皮质和髄质交界模糊,细胞排列紊乱,皮质萎缩;乳痈方各剂量组小鼠的胸腺组织皮质区和髄质边界较明显,皮质区细胞总数较模型组显著增多(P0.05,P0.01),髄质区细胞总数较模型组显著减少(P0.05,P0.01)。免疫组化检测显示,乳痈方干预后,模型小鼠胸腺组织上皮细胞标记物E-cadherin阳性表达增多,间质细胞标记物Vimentin阳性表达减少。②成功构建iTECs,iTECs与TECs形态相似,且高表达SV40基因和CK5蛋白。MTT检测和结晶紫染色观察显示,100、200、400μg/ml乳痈方干预可促进iTECs增殖(P0.01)。③TGF-β_1诱导后,iTECs逐渐变为长梭形,E-cadherin表达和mRNA水平降低(P0.05),Vimentin表达和mRNA水平上调(P0.05),且相关基因Snail 1和Zeb 1的mRNA水平显著升高(P0.01)。乳痈方干预可抑制TGF-β_1诱导的细胞形态向长梭形变化,上调E-cadherin表达和mRNA水平(P0.01),下调Vimentin表达和mRNA水平(P0.05,P0.01),且显著降低Snail 1和Zeb 1的mRNA水平(P0.01)。④TGF-β_1诱导可引起iTECs细胞Smad mRNA水平明显上调(P0.01),不同剂量乳痈方作用均可使Smad mRNA水平显著下调(P0.01),且低剂量组的信号通路活化程度较TGF-β_1组明显降低(P0.05)。结论:乳痈方可有效逆转乳腺癌小鼠胸腺上皮细胞的表型变化,其作用机制与抑制TGF-β_1/Smad通路有关。     

眼用微乳地塞米松的含量测定和稳定性研究

目的：建立HPLC测定地塞米松磷酸钠眼用微乳含量的方法并对其进行稳定性研究。方法：采用HPLC测定地塞米松磷酸钠眼用微乳的含量,同时对其进行稳定性研究。结果：地塞米松磷酸钠眼用微乳的含量符合规定,初步稳定性表明该制剂稳定。结论：地塞米松磷酸钠眼用微乳符合质量控制要求;HPLC法简便、快捷、灵敏,可作为其质量控制的有效方法。     

火神山医院新冠肺炎预防经典方中12种主成分的含量测定

目的 采用超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定火神山医院新冠肺炎预防经典方中 12 种主成分(黄芪甲苷、升麻苷、木犀草苷、金丝桃苷、毛蕊异黄酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陈皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊异黄酮、白术内酯-Ⅲ)的含量。方法 以利血平为内标,色谱柱为 ZORBAX SB-C₁₈(2. 1 mm×100 mm,3. 5 μm,Agilent,USA),流动相 A 为0. 1% 甲酸乙腈溶液,流动相 B 为 0. 1% 甲酸和 10 mmol/L 醋酸铵水溶液,梯度洗脱,流速 0. 3 ml/min,进样量 5 μl,柱温 40 ℃,运行时间 7. 2 min。根据药典 2015 版对建立的方法进行方法学验证,并对 3 批预防经典方中 12 种主成分的含量进行测定。结果 预防经典方中 12 种主成分在各自浓度范围内线性关系良好(r²>0. 98),重复性、稳定性、精密度、加样回收率等均符合检测要求。结论 本法操作简单、可靠,适用于预防经典方中 12 种主成分的含量测定,为火神山医院新冠肺炎预防经典方的质量控制提供了...     

基于NLRP3炎症通路研究通窍方对腺样体上皮细胞焦亡的影响

目的 探索通窍方含药血清抑制腺样体上皮细胞焦亡的作用机制。方法 选择2022年3月至2023年3月在银川市第一人民医院耳鼻喉科行腺样体切除术的腺样体肥大(adenoidal hypertrophy,AH)患儿,收集术后切除的腺样体组织,采用组织块贴壁法分离上皮细胞,并进行培养及鉴定。用透射电镜观察腺样体上皮细胞的超微结构;用CCK-8法筛选通窍方含药血清的最佳干预浓度。将培养至适宜浓度的人原代腺样体上皮细胞分为4组,分别是空白对照组、孟鲁司特钠组、通窍方组、MCC950组(MCC950,10μmol·L^-1)。各组给予相应的含药血清处理24 h后,采用RT-qPCR法和Western blot法分别检测NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-1)、白细胞介素(IL)1β、IL-18基因及蛋白表达水平;Tunnel染色法检测细胞凋亡情况;ELISA法检测IL-18、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。结果 AH患儿的原代腺样体上皮细胞呈不规则型,轮廓不清,折光性较差;免疫荧光细胞鉴定泛角蛋白阳性率高。透射电镜下腺样...     

回药扎里奴思方UPLC指纹图谱结合多成分含量测定的质控方法研究

目的 建立扎里奴思方的UPLC-PDA指纹图谱及多成分含量测定方法.方法 采用Waters ACQUITY UHPLC T3(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱,流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B),梯度洗脱,流速0.4 mL/min,柱温30℃,检测波长317 nm;采用UPLC-PDA对其中9种...     

液相色谱-串联质谱法测定尿中乳果糖、甘露醇和乳糖含量

目的建立液相色谱-串联质谱法（LC-MS／MS）测定人尿中乳果糖、甘露醇和乳糖含量。方法尿样用水和乙腈直接稀释后，以LunaNH2（100×2．0mm，5μm）为分析柱，乙腈-水（80：20，v／v）为流动相，0．3mL／min流速进行色谱分离。采用负离子化电喷雾、多反应监测（MRM）扫描方式进行质谱定量分析，离子通道选择m／z为：甘露醇181．1／88．9，乳果糖和乳糖341．3／160．9，内标353．4／166．9。结果甘露醇、乳果糖、乳糖和内标的保留时间分别为2．9、4．1、4．7和4．7min。在0、1～40μg／mL浓度范围内线性关系良好（r≥0．9980）。最低定量限分别为0．1μg／mL（甘露醇、乳果糖）和0．2μg／mL（乳糖）。日内、日间精密度（CV％）分别为0．60％～4．31％、2．55％～7．71％，准确度分别为86．4％～107．6％、95．9％～102．9％。回收率为84．7％～105．5％。结论该方法的样品处理简单快速，检测专一灵敏、准确可靠，可用于肠通透性评价中甘露醇及乳果糖的含量测定。     

补肾活血方中马钱苷、莫诺苷、芍药苷含量测定及其对免疫性卵巢早衰小鼠的影响

目的研究补肾活血方中马钱苷、莫诺苷、芍药苷含量测定方法及其对免疫性卵巢早衰小鼠激素血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E_2)水平的影响。方法 (1)采用HPLC,色谱柱Hypersil ODS C18柱(200 mm×4.6 mm,5μm),流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脱,柱温30℃,流速为1.0 mL/min,进样量10μL,测定补肾活血方中马钱苷、莫诺苷、芍药苷含量;(2)以小鼠透明带3为抗原,皮下多点注射BALB/c雌性小鼠,建立免疫性卵巢早衰模型,分别用补肾活血方、马钱苷、莫诺苷、芍药苷进行干预,并设空白组、模型组为对照,酶联免疫吸附法测定各组FSH、LH、E_2含量。结果 (1)马钱苷、莫诺苷、芍药苷的线性范围分别在58～1 160μg(r=1.000 0)、203～4 070μg(r=0.999 8)及117～2 340μg(r=0.999 4)内,线性关系良好;这3种成分的平均加样回收率分别为98.6%、98.0%、98.8%,RSD分别为2.18%、1.28%、1.77%;在补肾活血方中按生药量计算,莫诺苷、马钱苷、芍药苷的平均含量分别为(4.612±0.057) mg/g、(1.286±0.014) mg/g、(3.065±0.022) mg/g。(2)与空白组比较,模型组E_2水平显著降低(P0.01),FSH和LH的水平均明显升高(P0.01);与模型组比较,补肾活血方组、马钱苷组、莫诺苷组E_2水平均显著升高(P0.01),FSH和LH的水平均显著降低(P0.01),芍药苷组E_2水平显著升高(P0.01),LH的水平显著降低(P0.01),FSH水平降低(P0.05)。结论所建立的HPLC简便、灵敏、准确,可用于补肾活血方中莫诺苷、马钱苷、芍药苷的含量测定;马钱苷、莫诺苷、芍药苷为补肾活血方中可能的药效物质。     

平喘方对哮喘模型小鼠pDC/cDC通路的干预作用研究

[目的]通过观察平喘方对支气管哮喘模型小鼠肺组织浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)/传统DC(conventional DC,cDC)通路各因子的影响,阐释平喘方治疗哮喘的机制及药物间的相互作用。[方法]将40只雄性BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、地米组和平喘方组,每组10只。采用10%鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏液腹腔注射致敏和5%OVA雾化吸入激发,建立BALB/c小鼠支气管哮喘模型。小鼠激发开始时按20mL/kg·d灌胃相应的药物,用药1周后处死小鼠,采集支气管肺泡灌洗液,以ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的含量;分离小鼠肺组织,HE染色后镜下观察肺组织形态,Western blot检测肺组织中维甲酸相关孤儿受体(retinoid-related orphan nuclear receptor,RORγt)及叉头蛋白P3(forkhead box P3,FOXP3)的蛋白表达量;Real-time PCR测定肺组织中吲哚胺-2,3-二氧化酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)、肿瘤坏死因子超家族4(tumor necrosis factor superfamily4,TNFSF4)的基因相对表达量;Masson染色检测肺组织胶原蛋白面积、气道平滑肌面积(airway smooth muscle area,WAm)、气道内壁面积(airway inner wall area,WAi)。[结果]与空白组比较,模型组支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的含量以及肺组织中RORγt、TNFSF4表达均增高,FOXP3、IDO表达均降低,胶原蛋白面积、WAm、WAi均增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较,地米组、平喘方组病理切片表现均有所改善,支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的含量、肺组织中RORγt、TNFSF4表达均减低,FOXP3、IDO表达均增高,差异有统计学意义(P＜0.05);与地米组比较,平喘方组IL-17的含量、RORγt、TNFSF4、FOXP3、IDO的表达量及胶原蛋白面积、WAm、WAi差异无统计学意义(P＞0.05)。[结论]平喘方对pDC/cDC的干预可能是诱导气道免疫耐受的一个切入点,从而抑制T细胞表达失衡,改善气道炎症及气道重建。     

LC-MS/MS法定量检测恩格列净原料药中杂质的含量

目的：建立一种LC-MS/MS法用于定量检测恩格列净原料药中杂质X（简称EPLZ-X）的含量。方法采用Thermo BDS C18（4.6 mm ×100 mm,2.4μm）色谱柱,以乙腈-水（75∶25,V/V）为流动相,流速0.7 ml/min。质谱扫描方式选用正离子模式,用于定量的多反应监测（MRM）离子对为m/z 785→m/z 475（CE为43 V）和m/z 785→m/z 418（CE为50 V）。结果在0.5~100.6 ng/ml范围内线性关系良好,低、中和高浓度质控样品的日内精密度分别为5.9%、5.4%和7.9%。日间精密度分别为6.3%、11.8%和10.7%,加样回收率分别为105.1%、109.8%、102.6%,最低定量下限为0.5 ng/ml。结论使用此法成功测定了3批原料药中该杂质的含量,均符合要求（不得超过60×10-6 g）。本法专属性强,灵敏度高,可用于其他批次样品的分析。     

LC—MS／MS测定乌头属中药中8个生物碱含量

目的：建立LC-MS／MS测定乌头属中药8种生物碱含量的方法。方法：以甲醇-水（水相含0．1％甲酸和2．5mM醋酸铵溶液）为流动相,C18柱分离,采用ESI（＋）源,MRM监测,对制川乌、制草乌、制附子药材饮片中的双酯型生物碱（乌头碱、新鸟头碱、次乌头碱）,单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱）,胺醇型生物碱（乌头原碱、新鸟头原碱）进行含量测定。结果：上述8种生物碱的线性关系良好,精密度、重复性的RSD都低于6％,加样回收率为95．77％-101．90％。结论：该方法简便、快速、精密度高、重复性好,可应用于乌头属中药的质量控制。     

LC-MS/MS法测定人血浆中地高辛的浓度及其在儿童患者中的应用

建立了简单、快速、可靠的LC-MS/MS法测定人血浆中地高辛的浓度.以地高辛-d3为内标,血浆样品经液液萃取法处理后进样.色谱柱为Kinetex C18(2.1 mm×50 mm,2.6 μm;Phenomenex),流动相为均含1 mmol/L醋酸铵和1 mmol/L甲酸的水溶液和乙腈溶液(55∶45),采用等度洗脱...     

大鼠血浆中胆汁酸、胆红素及牛磺酸的LC-MS/MS分析

建立大鼠血浆中胆汁酸、胆红素和牛磺酸的LC-MS/MS同时测定方法。血浆样品经甲醇沉淀蛋白后LC-MS/MS分析,色谱柱为Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm,5μm),流动相为甲醇-10 mmol/L醋酸铵溶液(pH 3.0)梯度洗脱;检测系统采用电喷雾离子源(ESI)-三重四极杆质谱仪于负离子模式下进行选择性反应检测(SRM)。方法学验证结果表明,建立的方法灵敏度高、专属性好,可用于血浆样品中胆汁酸、胆红素和牛磺酸的含量测定。     

液相色谱-串联质谱法测定原发性肝癌患者血清中7种甾类激素

目的 建立高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法,用于测定原发性肝癌患者血清中7种甾类激素的含量.方法 血清样品采用乙酸乙酯液-液萃取,经丹磺酰氯衍生化后测定.色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(2.1 mm×150mm,2.7μ.m),流动相为乙腈-0.1％(V∶V)甲酸水溶液,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为35℃,质谱检测采用动态多反应离子监测模式(MRM).结果 7种甾类激素(雌二醇、雌三醇、雌酮、氢化可的松、睾酮、雄烯二酮和黄体酮)在8 min内达到基线分离.在相应浓度范围内线性关系良好,相关系数均＞0.99,日内及日间精密度RSD均＜15％,提取回收率为80％～119％,基质效应为85％～112％,样品在放置6h后处理、处理后室温放置24 h、3个冻融循环以及-80℃保存30 d等测定过程中均稳定性良好.结论 该方法操作简便、结果准确、灵敏度高、重现性好,适用于原发性肝癌患者体内甾类激素水平检测.     

UHPLC-MS/MS法同时测定补骨脂药材中17种成分的含量

[目的] 建立UHPLC-MS/MS法同时测定25批补骨脂中17种成分的含量。[方法] 采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱技术检测,色谱柱为Thermofisher Scientific Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm 1.9 μm）,流动相为水（A）-乙腈（B）,梯度洗脱,进样量为3 μL,流速为0.2 mL/min,柱温40 ℃;离子源为电喷雾离子源（ESI）;在多反应检测（MRM）模式下正、负离子同时测定。[结果] 补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、4,5-去氢异补骨脂定、补骨脂查尔酮、异补骨脂色烯查尔酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂宁、补骨脂定、补骨脂甲素、补骨脂乙素、8-甲氧基补骨脂素、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、5-甲氧基补骨脂素、巴库查尔酮、Corylifol A 17 种成分线性关系良好（r>0.99）,平均加样回收率（n=6）为95.66%~101.38%,RSD为0.77%~3.04%;精密度、重复性,稳定性试验的RSD均小于2.57%,符合分析要求。含量测定显示,不同批次补骨脂中各成分含量差别较大。[结论] 本实验建立的检测方法快速、准确、重复性好,可适用于补骨脂的质量控制研究。     

LC-MS/MS法研究头孢美唑钠中有关物质

建立采用LC-MS/MS法对头孢美唑钠中有关物质进行定性分析。采用ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,以1%甲酸水溶液-乙腈为流动相线性梯度洗脱;柱后分流,80%流出液经PDA检测,20%流出液电喷雾离子化MS测定。采集有关物质的PDA谱、质谱母离子及子离子谱,进行解析推测有关物质的结构。在所建立的条件下,头孢美唑钠及其有关物质分离良好,检测出8个有关物质,对其结构进行解析。建立的LC-MS/MS法有效地分离分析了头孢美唑钠及其有关物质,为其质量控制和工艺优化提供了技术参考。     

LC-MS／MS 法分析注射用头孢唑林钠中的有关物质

目的：建立对注射用头孢唑林钠中有关物质进行定性分析的 LC-MS/MS 法。方法采用 Phenome-nex ODS（250 mm×4．6 mm,5μm）为色谱柱;10 mmol 醋酸铵水溶液为流动相 A,乙腈为流动相 B 的挥发性流动相线性梯度洗脱。采集有关物质的 PDA 谱、质谱母离子及子离子谱,并进行结构解析,推测有关物质的结构。结果在所建立的条件下,注射用头孢唑林钠中有关物质分离良好,检出11个有关物质峰。结论本文建立的LC-MS/MS 法可有效地分离分析注射用头孢唑啉钠中的有关物质,并为其质量控制和工艺纯化提供技术参考。     

固相萃取LC-MS/MS法测定疏血通注射液中次黄嘌呤浓度

[目的]建立固相萃取液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定疏血通注射液中次黄嘌呤浓度。[方法]疏血通注射液经固相萃取柱处理后,采用LC-MS/MS进行含量测定。色谱柱为Acquity BEH C18分析柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),以甲醇-水(含0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 mL/min。于ESI负离子模式下,以多反应离子监测(MRM)扫描方式进行监测,用于定量分析的离子为m/z 134.9→92.0(次黄嘌呤)和m/z 151.0→92.1(内标6-巯基嘌呤)。[结果]次黄嘌呤在质量浓度0.1～0.5μg/mL范围内与待测物和内标的峰面积比值呈良好线性关系(r=0.999 8),平均加样回收率为98.7%,RSD为0.31%。[结论]该方法简便、准确、灵敏,可用于疏血通注射液中次黄嘌呤的浓度测定。     

液-质联用技术鉴定安立生坦有关物质

采用液相色谱-飞行时间质谱(LC-TOF/MS)和液相色谱-二级质谱联用(LC-MS/MS)两种液-质联用技术对安立生坦有关物质进行结构鉴定。采用XBridge C₁₈(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)色谱柱,以乙腈-水溶液(含0.15%甲酸)为流动相线性梯度洗脱,对安立生坦及其有关物质进行分离;通过电喷雾正离子化TOF/MS检测,并结合MS/MS碎片和对照品对照鉴定各有关物质的结构。在建立的色谱条件下安立生坦及其有关物质均分离良好,共检测到10个有关物质,并通过联用技术和有机反应机制解析确证了它们的结构。液-质联用技术能够有效地鉴定安立生坦有关物质,为其质量控制和工艺优化提供参考依据。