miR-342-5p 调控靶基因Merlin 表达促进肝细胞癌侵袭转移的实验研究

目的：探讨miR-342-5p及其可疑靶基因Merlin在肝细胞癌（HCC）中表达及意义。 方法：用qRT-PCR检测miR-342-5p和Merlin mRNA在HCC组织与癌旁组织，以及正常肝细胞系与各种不同HCC细胞系中的表达；用重组慢病毒包装质粒pGCSIL-GFP-miR-342-5p或空载体（阴性对照）转染HCCLM3细胞，以无处理的HCCLM3细胞作为空白对照，划痕愈合及Transwell实验观察细胞侵袭运动能力；Western blot法检测细胞中Merlin蛋白的表达。采用双荧光素酶基因报告系统，将含野生型或突变型Merlin基因3''UTR质粒（psiCHECK-Merlin）分别与pGCSIL-GFP-miR-342-5p、空载体（阴性对照）共转染或单独转染（空白对照）HCCLM3细胞后，检测各组细胞荧光素酶活性。 结果：与癌旁组织比较，HCC组织中miR-342-5p表达明显上调，Merlin mRNA表达明显下调（均P<0.05）；HCC组织中，血管侵犯组较无血管侵犯组miR-342-5p表达明显上调，Merlin mRNA表达明显下调（均P<0.05），且miR-342-5p与Merlin mRNA表达呈负相关（r2=5.364，P<0.05）。各HCC细胞系中miR-342-5p表达均明显高于正常肝细胞系，且miR-342-5p的表达随HCC细胞系的侵袭性增高而上调，而Merlin mRNA表达则呈相反趋势（均P<0.05）。与空白对照组及阴性对照组比较，HCCLM3细胞转染pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒后，细胞侵袭运动能力明显下降（均P<0.05），而Merlin蛋白表达明显上调。psiCHECK-Merlin野生型与pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒共转染HCCLM3细胞后，细胞的荧光素酶活性较其阴性对照组或空白对照组明显降低（P<0.05），而psiCHECK-Merlin突变型与pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒共转染HCCLM3细胞后，细胞的荧光素酶活性与其空白对照组或阴性对照组无统计学差异（P>0.05）。 结论：Merlin是miR-342-5p的靶基因，miR-342-5p可能通过调控MerlinmRNA的表达促进肝细胞癌侵袭转移。     

长链非编码RNA PCAT19对胰腺癌细胞增殖与侵袭的影响及其作用机制

背景与目的 长链非编码RNA PCAT19（lncRNA PCAT19，简称PCAT19）在多种肿瘤中表达上调，且与恶性进展和不良预后密切相关。然而，PCAT19在胰腺癌中的表达、功能及作用机制尚无研究报道。笔者前期通过starBase数据库预测PCAT19可与miR-195-5p互补结合，因此，本研究探讨PCAT19在胰腺癌细胞中的表达与作用，及其与靶基因和相应miRNA的调控关系。方法 用qRT-PCR检测人胰腺导管上皮细胞系（HPNE）和胰腺癌细胞系（PANC-1、SW1990、HS766T、CFPAC-1）中PCAT19及miR-195-5p的表达。用双萤光素酶报告基因分析PCAT19与miR-195-5p的靶向结合作用。将PANC-1细胞分别转染PCAT19沉默序列si-PCAT19（si-PCAT19组）、阴性对照序列（si-NC组）、miR-195-5p抑制序列+si-PCAT19（共转染组）后，用MTT测定细胞增殖能力，Transwell测定细胞侵袭能力，Western blot检测Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白的表达。结果 各胰腺癌细胞系中PCAT19表达水平均明显高于HPNE细胞，而miR-195-5p的表达水平均明显低于HPNE细胞（均P<0.05）。双萤光素酶实验显示miR-195-5p是PCAT19的靶miRNA。与si-NC组PANC-1细胞比较，si-PCAT19组PANC-1中miR-195-5p表达水平明显升高，细胞增殖能力与侵袭能力明显降低，β-catenin、c-Myc和cyclin D1表达水平明显下调（均P<0.05），而共转染组以上各项指标与si-NC组差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论 PCAT19在胰腺癌细胞中表达升高，其可促进胰腺癌细胞增殖和侵袭，机制可能与调控miR-195-5p并影响Wnt/β-Catenin信号通路有关。     

miR-204-5p/TNFRSF12A轴对甲状腺乳头状癌细胞侵袭能力的影响及机制

背景与目的 前期，笔者通过生物信息学分析和验证发现miR-204-5p在甲状腺乳头状癌（PTC）中呈低表达，并可能是PTC发生发展中的关键分子。因此，本研究进一步探讨miR-204-5p对PTC细胞侵袭能力的影响及机制。方法 采用Transwell实验检测miR-204-5p过表达和敲低对PTC细胞系TPC-1细胞的侵袭能力影响；通过miRDB网站预测miR-204-5p下游靶基因，并采用Western blot实验、Transwell实验、GEPIA数据库分析及双荧光素酶报告基因实验验证。结果 Transwell实验结果显示，过表达miR-204-5p的TPC-1细胞侵袭能力明显降低，而miR-204-5p抑制的TPC-1细胞侵袭能力明显增强（均P<0.05）。miRDB网站预测显示，TNFRSF12A可能为miR-204-5p下游靶基因；Western blot结果显示，过表达miR-204-5p的TPC-1细胞TNFRSF12A表达下调，而miR-204-5p抑制的TPC-1细胞TNFRSF12A表达上调；过表达TNFRSF12A的TPC-1细胞侵袭能力明显增强，TNFRSF12A抑制的TPC-1细胞的侵袭能力明显降低；TNFRSF12A可逆转miR-204-5p对TPC-1细胞侵袭能力的影响（均P<0.05）。GEPIA数据库分析显示，TNFRSF12A在PTC组织中高表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示，TNFRSF12A是miR-204-5p的靶基因。结论 miR-204-5p可靶向结合TNFRSF12A mRNA的3''UTR抑制TNFRSF12A的表达，而PTC细胞中miR-204-5p表达下调，削弱了其对TNFRSF12A表达的抑制，从而导致PTC细胞侵袭能力增强。     

circZMYM2/miR-29a/PUMA轴对急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的影响及作用机制

背景与目的 腺泡细胞凋亡在急性胰腺炎（AP）炎症反应和病情进展中发挥重要作用，进一步了解腺泡细胞的凋亡机制及相关通路有助于为AP特异性治疗提供新思路。本研究探讨锌指蛋白基因ZMYM2转录环状核糖核酸（circZMYM2）、微小RNA-29a（miR-29a）与p53上调凋亡调节因子（PUMA）在AP中的表达及其之间的潜在关系。方法 将大鼠胰腺腺泡细胞AR42J用雨蛙素诱导AP体外模型（AP组），或先通过pcDNA3.1-si-ZMYM2转染，敲低circZMYM2后再用雨蛙素诱导AP体外模型（si-circZMYM2组），以无处理的AR42J细胞作为对照组。3 h后分别用ELISA法检测细胞淀粉酶水平、CCK-8法检测细胞活力、流式细胞术与TUNEL法检测细胞凋亡情况、Western blot法检测细胞PUMA蛋白表达、qRT-PCR检测细胞circZMYM2与miR-29a表达。结果 与对照组比较，AP组与si-circZMYM2组淀粉酶水平均明显升高、细胞活力均明显降低、细胞凋亡率或凋亡细胞数均明显增加、PUMA蛋白表达水平均明显升高，但si-circZMYM2组以上指标的变化程度均明显低于AP组（均P<0.05）。与对照组比较，circZMYM2表达水平在AP组明显升高，在si-circZMYM2组明显降低，而miR-29a表达水平在AP组明显降低，在si-circZMYM2组明显升高（均P<0.05）。结论 circZMYM2在AP的腺泡细胞中表达升高，其可能通过与miR-29a内源性竞争作用，抑制miR-29a的表达，从而上调PUMA表达水平，促进腺泡细胞凋亡和AP进展。     

磷酸丝氨酸磷酸化酶在肝细胞癌中的表达及其促进增殖和转移的作用机制

背景与目的 磷酸丝氨酸磷酸化酶（PSPH）在多种肿瘤中表达上调,发挥促进肿瘤生长和转移的作用,但其在肝细胞癌（HCC）中的作用尚未完全清楚。因此,本研究旨在探讨PSPH在HCC中的表达与作用及其作用机制。方法 分别用Western blot和qRT-PCR检测PSPH在HCC组织和癌旁组织中以及不同HCC细胞株（HepG2、Huh-7、HCCLM3）与正常肝细胞株（HL-7702）中的表达。HepG2细胞过表达或敲低PSPH后,分别用CCK-8、EdU染色、Transwell侵袭实验及Western blot法检测PSPH对HepG2细胞增殖、侵袭以及细胞增殖标记蛋白CCND1和Ki-67表达的变化;同时,用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I、p62以及侵袭相关蛋白MMP-9的表达,用免疫荧光法检测p65蛋白入核情况。结果 与癌旁组织比较,HCC组织中PSPH蛋白的表达明显上调;与正常肝细胞比较,各HCC细胞株中的PSPH基因的表达明显升高（均P<0.05）。过表达PSPH后,HepG2细胞的增殖和侵袭能力明显增强,CCND1和Ki-67的表达明显上调,LC3-II/LC3-I表达上调而p62表达下调,p65蛋白核转位明显增加,MMP-9表达明显上调（均P<0.05）;敲低PSPH后,HepG2细胞的上述指标均呈相反变化（均P<0.05）。NF-κB通路抑制剂能抑制过表达PSPH对p65入核的促进作用和对MMP-9的上调作用,而NF-κB通路激动剂能逆转敲低shikonin对p65入核的抑制作用和对MMP-9的下调作用（均P<0.05）。结论 TNF-α在HCC中表达上调,PSPH高表达能增强HCC细胞增殖与转移能力,其作用机制可能涉及对自噬的抑制作用以及对NF-κB/MMP-9信号通路的活化作用。     

miR-542-3p对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响及其靶基因预测

目的 明确miR-542-3p对骨肉瘤细胞系HOS和SAOS2细胞侵袭能力的影响,通过生物信息学建立miR-542-3p靶基因调控网络,并探讨其潜在作用靶点。方法 使用miR-542-3p mimics转染HOS和SAOS2细胞,同时设立正常组（未转染）及阴性对照组（转染miR-neg mimics）,Transwell小室试验检测转染后细胞的侵袭能力。通过美国国立生物信息中心（NCBI）基因表达共享数据库（GEO）联合GEO2R平台,获取并分析miRNA-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的基因表达谱数据及其差异表达基因,进而使用miRNA预测数据库及Cytoscape软件,预测并建立miR-542-3p靶基因调控网络。实时荧光定量PCR验证miR-542-3p转染HOS和SAOS2细胞后,部分预测目标靶基因的mRNA表达水平变化。结果 miR-542-3p干预组HOS和SAOS2细胞的侵袭能力较正常组和阴性对照组明显降低（P均＜0.05）。数据库差异基因分析表明,miR-542-3p与miR-neg转染的U2OS细胞的表达差异基因共有417个,其中185个基因表达下调。miRNA预测数据库预测的266个靶基因中,有14个与差异基因分析中得到的表达下调基因重合。实时荧光定量PCR分析得出,ILK、TBPL1、ETS1这3个预测靶基因在miR-542-3p干预组中的表达水平显著低于阴性对照组,差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 miR-542-3p通过下调ILK、TBPL1、ETS1显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。     

微RNA-23a通过缝隙连接蛋白43对颈椎后纵韧带细胞骨向分化的作用机制

目的 探讨微RNA（miR）-23a通过缝隙连接蛋白43（Cx43）对颈椎后纵韧带细胞骨向分化的作用及相关机制。方法 选取本院收治的50例间断型颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）患者（OPLL组）、50例颈椎外伤非OPLL患者（对照A组）和50例颈椎病非OPLL患者（对照B组）颈椎后纵韧带组织，培养后纵韧带细胞，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测3组细胞miR-23a、Cx43 mRNA的表达，采用Western blotingt检测Cx43蛋白的表达。取OPLL组对数期后纵韧带细胞，分别转染miR-23a agomir质粒（miR-23a过表达组）、miR-23a antagomir质粒（miR-23a低表达组）、agomir NC质粒（转染对照组），未经处理的后纵韧带细胞为空白组。采用双荧光素酶实验验证miR-23a与Cx43的靶向关系；采用碱性磷酸酶（ALP）染色检测矿化情况；采用Western blotingt检测p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的蛋白表达。结果 与对照A、B组比较，OPLL组miR-23a表达降低，Cx43 mRNA及蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与空白组、转染对照组比较，miR-23a过表达组miR-23a表达量升高、Cx43 mRNA表达量降低，miR-23a低表达组miR-23a表达量降低、Cx43 mRNA表达量升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。双荧光素酶实验显示，miR-23a可有效抑制野生型质粒荧光素酶活性；与空白组、转染对照组比较，miR-23a过表达组矿化面积百分比、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达降低，miR-23a低表达组矿化面积百分比、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达、p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论OPLL病理条件下，颈椎后纵韧带细胞中miR-23a异常低表达，通过靶向上调Cx43激活MAPK信号通路，促进成骨分化。     

miR-18a-3p在肝癌中的表达及其调控ADCY1表达对肝癌细胞侵袭及增殖的影响

背景与目的 研究表明多种microRNA（miRNA）可能在肝癌的发生发展中发挥重要作用,其作用机制仍值得进一步研究和探讨。因此,本研究从已报道的肝癌差异表达miRNA中进一步筛选关键miRNA,并验证和探讨其作用机制。方法 从已发表的研究中筛选出肝癌组织及肝癌患者血清/血浆中与正常肝组织及正常血清/血浆中共同的差异表达miRNA;用qRT-PCR在正常肝细胞与肝癌细胞中对筛选出的目标miRNA表达情况进行验证;用过表达和抑制的方法观察目标miRNA对肝癌细胞侵袭能力（Transwell实验）与增殖能力（MTT实验）的影响,以及在30例临床标本中检测目标miRNA的表达并通过KM plotter网站分析其对肝癌患者生存的影响;通过miRDB和GEPIA数据库预测和分析目标miRNA的靶基因,并用逆转实验和双荧光素酶报告实验进一步验证。结果 在肝癌组织（vs.正常肝组织）及肝癌患者血清/血浆（vs.正常人血清/血浆）中共同高表达的miRNA有4个（miR-18a-3p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-224-3p）,共同低表达的miRNA有2个（miR-26a-3p、miR-125b-3p）。qRT-PCR实验证实,与正常肝细胞比较,miR-18a在肝癌细胞中高表达,miR-26a在肝癌细胞中低表达（均P<0.05）。过表达/抑制miR-18a-3p表达能促进/降低肝癌细胞的侵袭及生长能力（均P<0.05）,而过表达/抑制miR-26a-3p对肝癌细胞的侵袭及生长能力影响无不法确定。分析结果显示,ADCY1是miR-18a-3p的靶基因,过表达ADCY1能部分逆转miR-18a-3p对肝癌细胞的上述作用,同时,表达上调的miR-18a-3p能通过结合到ADCY1 mRNA 3''UTR抑制ADCY1的表达。结论 miR-18a-3p可能在肝癌的发生发展中起了关键作用,其在肝癌中表达上调,并能通过抑制下游靶基因ADCY1的表达增强进肝癌细胞的侵袭和增殖能力。     

结直肠癌干细胞中miR-520c-3p的表达及其对丙酮酸代谢的调控机制研究

背景与目的 研究显示,丙酮酸代谢的改变在结直肠癌的发生发展中起重要作用,而结直肠癌干细胞中microRNA（miRNA）表达异常可能与丙酮酸代谢密切相关。笔者前期通过TCGA数据库分析发现,miR-520c-3p在结直肠癌中表达升高,且与预后相关。然而,miR-520c-3p是否参与了丙酮酸代谢尚不清楚。因此,本研究探讨结直肠癌干细胞中miR-520c-3p的表达与丙酮酸代谢的关系。方法 选择人结肠癌细胞株,并从中分离纯化结直肠癌干细胞。检测过表达或敲低miR-520c-3p后,结直肠癌干细胞及结直肠癌细胞增殖能力、丙酮酸氧化水平、乳酸产量的变化。用_D-［U-¹³C］葡萄糖孵育细胞,质量同位素分析追踪葡萄糖衍生碳的命运。通过miRNA序列分析和遗传学手段分析和鉴定miR-520c-3p的功能底物。结果 过表达miR-520c-3p后,结直肠癌干细胞的增殖能力明显增强、丙酮酸氧化水平明显下降、乳酸产量明显升高（均P<0.05）;用_D-（U-¹³C）葡萄糖培养后,未标记的柠檬酸盐（m+0）明显增加,而高阶柠檬酸盐标记（m+1、m+4和m+5）明显减少（均P<0.05）。在敲低miR-520c-3p后,结直肠癌干细胞的上述情况呈反向变化（均P<0.05）。过表达或敲低miR-520c-3p对结直肠癌细胞的上述指标均无明显影响（均P>0.05）。miR-520c-3p可以靶向线粒体丙酮酸载体1（MPC1）mRNA 3''UTR（P<0.05）。过表达miR-520c-3p后,结直肠癌干细胞中MPC1的mRNA与蛋白水平均明显下降,敲低miR-520c-3p后则相反（均P<0.05）。TCGA数据库分析结果显示,低表达MPC1的结直肠癌患者预后较差（P<0.05）。敲低MPC1后,结直肠癌干细胞的丙酮酸氧化水平明显降低、乳酸产量明显增高、增殖能力均明显增强（均P<0.05）;用_D-［U-¹³C］葡萄糖培养后,未标记的柠檬酸盐（m+0）在敲低MPC1的结直肠癌干细胞中明显增加,而高阶柠檬酸盐标记（m+1、m+4和m+5）明显减少（均P<0.05）。同时敲低miR-520c-3p和MPC1后,结直肠癌干细胞丙酮酸氧化水平、乳酸产量、增殖能力均无明显变化（均P>0.05）。结论 结直肠癌中miR-520c-3p的高表达与较差的预后相关,其机制可能是miR-520c-3p靶向MPC1调控结直肠癌干细胞中的丙酮酸代谢水平,促进了结直肠癌干细胞的增殖。     

结直肠癌细胞中NF-κB活化与TRAF6、CCR5及PTEN/PI3K通路的关系及作用

背景与目的 NF-κB的活化在多种恶性肿瘤的发生、发展中起了重要的作用。研究发现，趋化因子受体5（CCR5）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）以及PTEN/PI3K通路相关蛋白均在恶性肿瘤中异常表达。因此，本研究探讨以上分子在结直肠癌细胞中的作用及相互关系。方法 分别用Western blot、CCK-8实验、Transwell法检测结直肠癌HT29和SW480细胞经Maraviroc（CCR5抑制剂）、MG132（TRAF6抑制剂）和NF-BAY（NF-κB抑制剂）处理后，各蛋白表达的变化，以及增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果 在两种结直肠癌细胞中，抑制CCR5蛋白后，PI3K的表达降低，PTEN表达升高（均P<0.05），TRAF6和NF-κB表达无明显变化（均P>0.05）；抑制TRAF6蛋白后，PI3K和CCR5表达降低，PTEN表达升高（均P<0.05），NF-κB的表达无明显变化（均P>0.05）；抑制NF-κB表达后，CCR5、TRAF6和PI3K表达降低，PTEN表达升高（均P<0.05）。三种抑制剂均可明显降低两种结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力（均P<0.05）。结论 结直肠癌细胞中存在NF-κB异常活化，后者可能通过上调TRAF6与CCR5的表达，抑制抑癌分子PTEN的活性，从而导致促癌分子PI3K及其通路的活性升高。     

长链非编码RNA 909靶向调控miR-194-5p/DACH1轴对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

背景与目的:长链非编码RNA 909(LINC00909)是一个新发现的长度约为2 kb的长链非编码RNA(lncRNA),在胶质瘤和白血病中被报道发挥癌基因的作用.然而LINC00909在胰腺癌中的作用鲜有报道.本研究旨探讨LINC00909在胰腺癌中的表达及其对患者预后的影响,以及LINC00909与其调控网络对胰...     

miR-150-5p抑制肝癌细胞的迁移和侵袭及其机制

目的:探讨mi R-150-5p在肝细胞癌(HCC)细胞迁移与侵袭中的作用及其调控机制。方法:用荧光定量PCR测定mi R-150-5p在正常肝细胞系L02及HCC细胞系Hep G2中的表达;将Hep G2细胞分成两组,分别转染mi R-150-5p(mi R-150-5p组)与随机序列(对照组),转染后,分别用细胞划痕实验、Transwell小室基质渗透实验检测细胞的迁移和侵袭能力,用Western blot检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的蛋白表达。结果:mi R-150-5p的表达量在Hep G2细胞系中明显降低,为L02细胞系的0.26倍(P0.01)。转染后,mi R-150-5p组的mi R-150-5p水平明显升高,为对照组的9.53倍(P0.001);mi R-150-5p组的细胞划痕愈合率明显低于对照组(54.63%vs.87.51%,P0.01),细胞侵袭数明显少于对照组(138个vs.452个,P0.01);MMP2与MMP9蛋白表达量均明显低于对照组(0.78 vs.1.75;0.82 vs.1.85,均P0.05)。结论:mi R-150-5p在HCC细胞中表达降低,升高mi R-150-5p的表达可抑制HCC细胞的迁移和侵袭,机制可能与其下调MMP2和MMP9表达有关。     

miR-96的表达对肝细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

目的:探讨miR-96在肝细胞癌(HCC)细胞中的表达及作用。方法:用qRT-PCR测定miR-96在不同HCC细胞系(HepG2、7721、huh7)及正常肝细胞系L02中的表达;将HepG2细胞分别转染miRNA随机序列(阴性对照组)、miR-96模拟物(miR-96模拟物组)和miR-96抑制物(miR-96抑制物组)后,用细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验分别检测细胞迁移及侵袭能力,qRT-PCR及Western blot分别测定PTPN9 mRNA及蛋白的表达。结果:miR-96在各肝癌细胞系中的相对表达量均明显高于其在正常肝细胞系L02的相对表达量(均P0.01)。与阴性对照组比较,细胞划痕愈合率在miR-96模拟物组明显升高,而在miR-96抑制物组明显降低(均P0.05);侵袭细胞数在miR-96模拟物组明显增多,而在miR-96抑制物组明显减少(均P0.05);PTPN9 mRNA与蛋白相对表达量在miR-96模拟物组均明显下调,而在miR-96抑制物组均明显上调(均P0.05)。结论:miR-96在HCC细胞中表达升高,并可能通过下调PTPN9表达促进HCC细胞的迁移与侵袭。     

长链非编码核糖核酸LINC00261通过miR-148b-3p/PTEN途径对高糖环境中HK-2细胞的保护作用

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC00261在糖尿病肾病中的表达,及其可能通过微小核糖核酸miR-148b-3p/PTEN途径对高糖环境中HK-2细胞的保护作用。 方法选择2016年3月至2018年5月本院的19例糖尿病肾病患者和23例健康对照者,采集血样,通过实时定量PCR(qRT-PCR)测定LINC00261和miR-148b-3p的表达。在细胞实验中,将HK-2肾小管上皮细胞分为7组：正常葡萄糖组(5.5 mmol/L培养,NG组)、高葡萄糖糖组(30.0 mmol/L培养,HG组)、其余5组也均为高葡萄糖培养：空质粒转染pcDNA(HG+pcDNA组)、转染LINC00261(HG+pcDNA-LINC00261组)、转染阴性对照anti-miR-NC(HG+anti-miR-NC组)、转染抑制剂anti-miR-148b-3p(HG+anti-miR-148b-3p组)、LncRNA和miRNA同时转染(HG+pcDNA-LINC0026+miR-148b-3p组)。应用Western印迹、细胞计数试剂盒8和流式细胞术分别检测PTEN蛋白表达、细胞增殖与凋亡。测超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒分别检测SOD活性和MDA含量。双荧光素酶报告实验用于LINC00261、miR-148b-3p、PTEN的相互关系鉴定。 结果与健康对照者比较,糖尿病肾病患者的LINC00261表达明显降低,而miR-148b-3p表达则明显增高(P<0.05)。过表达LINC00261或抑制miR-148b-3p后,高糖环境中HK-2细胞的miR-148b-3p表达、细胞凋亡及MDA含量均下降,而PTEN蛋白表达、细胞增殖及SOD活性均增高(P<0.05)。 结论LINC00261可能通过调控miR-148b-3p/PTEN途径,促进高糖环境中HK-2肾小管上皮细胞增殖、降低氧化应激、减少细胞凋亡。     

miR-542-3p对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制探讨

目的 探讨microRNA-542-3p(miR-542-3p)在人肝癌细胞系及组织中的表达水平及其对肝癌细胞增殖、侵袭转移能力的影响.方法 采用RT-PCR检测miR-542-3p在肝癌细胞系(HCCLM3、Hep3B、Huh7、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L)以及人正常肝细胞LO2中的表达;...     

肝细胞癌中miR-574-5p的表达与作用及其与预后的关系

背景与目的:研究表明,miR-574-5p与多种肿瘤预后密切相关,但尚未见miR-574-5p与肝细胞癌(HCC)的关系报道.因此,本研究初步探讨miR-574-5p在HCC中表达及其与患者预后的关系.方法:用qRT-PCR检测130例HCC与癌旁组织及HCC细胞系(HepG2、MHCC-97H)与正常肝细胞系(L-0...     

microRNA-671-5p在肝细胞癌中的表达及其负向调控丝切蛋白2与上皮细胞-间质转化的关系

背景与目的:近年研究发现,microRNA-671-5p(miR-671-5p)参与了多种恶性肿瘤的发生发展,同时与多种病毒介导的肝损伤相关,但其与肝细胞癌(HCC)之间的关系目前仍未见报道。本研究的目的为观察miR-671-5p在HCC中的表达情况,分析其功能及其与HCC生物学行为及临床病理特征的联系,并初步探讨作用机制。方法:用qRT-PCR检测80例HCC组织及癌旁组织样本、不同HCC细胞系(Hep3B、MHCC-97H、HepG2、SMMC-7721)及人正常肝细胞(L02)中miR-671-5p的表达,且在同时分析TCGA数据库中miR-671-5p在HCC组织与癌旁组织的表达差异。分析miR-671-5p表达量与临床病理因素的关系;用miR-671-5p抑制物敲低MHCC-97H细胞系中miR-671-5p的表后,分别采用CCK-8实验及Transwell实验分别检测HCC细胞转染miR-671-5p抑制物后增殖、侵袭及迁移能力的变化。利用TargetScan及Starbase网站预测miR-671-5p的靶基因,并通过Western blot、双荧光素酶实验及TCGA数据库分析验证。用Western blot观察降低miR-671-5p表达对HCC细胞中miR-671-5p靶基因及上皮细胞-间质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、vimentin)表达的影响,以及在此基础上同时敲低靶基因的表达后,以上蛋白表达的变化。结果:miR-671-5p的表达在HCC组织中明显高于其癌旁组织,在各种HCC细胞系中均明显高于正常肝细胞,且随着样本肿瘤分期与HCC细胞的侵袭力的增加而升高(均P0.05);TCGA数据库分析也显示,miR-671-5p在HCC组织中的表达量明显高于癌旁组织(P0.05)。miR-671-5p的表达水平与AFP水平、肿瘤数目、静脉侵犯、Edmondson-Steiner分级及TNM分期明显有关(均P0.05)。转染miR-671-5p抑制物后,MHCC-97H细胞的增殖、侵袭及迁移能力均明显降低(均P0.05)。生物信息学分析及双荧光素酶实验均显示丝切蛋白2(CFL2)是miR-671-5p潜在靶基因,TCGA数据库分析也显示miR-671-5p与CFL2的表达呈负相关(均P0.05)。降低MHCC-97H细胞中miR-671-5p的表达后,CFL2蛋白的表达水平升高,同时EMT相关蛋白表达明显降低(均P0.05),但同时干扰CFL2的表达后,以上变化均有明显程度的逆转(均P0.05)。结论:miR-671-5p在HCC中表达上调,且与HCC的不良临床病理特征密切相关。miR-671-5p可促进HCC细胞的增殖、侵袭、迁移,其机制可能与抑制CFL2的表达而促进EMT发生有关。     

肝细胞癌中miR-942-5p的表达及其与患者恶性特征及不良预后的关系

目的:探讨微小RNA-942-5p(miR-942-5p)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达及其功能。方法:用实时定量PCR检测西安交通大学第一附属医院样本库保存的73例HCC组织和对应癌旁组织中miR-942-5p的表达。分析miR-942-5p表达与HCC患者临床病理资料的关系,同时分析TCGA数据库中miR-942-5p表达与HCC患者总生存率的关系。Transwell小室检测干扰miR-942-5p表达后HCC细胞迁移和侵袭能力的变化,StarBase V3.0网站和荧光素酶报告基因质粒预测分析miR-942-5p的下游靶点,并用Western blot验证。结果:miR-942-5p表达量在HCC组织中明显高于对应癌旁组织(2.390 vs. 1.764,P0.05)。miR-942-5p表达量与HCC患者肿瘤数目、血管浸润和临床分期明显有关(均P0.05)。miR-942-5p高表达HCC患者总生存率明显低于miR-942-5p低表达HCC患者(19.535%vs. 53.873%,P0.05)。沉默miR-942-5p表达后,肝癌HCCLM3和MHCC97H细胞迁移和侵袭能力明显减弱(均P0.05)。预测与分析结果显示,扣针蛋白5(FBLN5)是miR-942-5p的直接下游靶点(P0.05),沉默miR-942-5p表达导致HCCLM3和MHCC97H细胞中FBLN5表达增加。结论:miR-942-5p在HCC组织中表达异常升高并与恶性临床特征和不良预后密切相关,机制可能与miR-942-5p抑制FBLN5表达促进HCC细胞迁移和侵袭有关。