大鼠牙囊细胞体外培养与表型鉴定

目的：体外培养大鼠牙囊细胞（RDFCs）,鉴定其细胞来源及表型,为牙周组织再生的研究提供可靠的种子细胞来源。方法：选择出生后6-7d SD仔鼠,分离上、下颌第一、第二磨牙牙胚,取牙囊组织进行原代和传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况;波形丝蛋白（Vimentin,VIM）和角蛋白（Cytokeratin,CK）鉴定其细胞来源;免疫组化染色技术检测细胞骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、Ⅰ型胶原（type Ⅰ collagen,CoL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（typeⅢ collagen,CoL-Ⅲ）及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达。结果：细胞形态呈多形性,有长梭形,纺锤形、不规则三角形等,波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。免疫组化染色显示OPN、BSP、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ、FN在胞浆中呈不同程度的阳性表达。结论：大鼠牙囊细胞来源于外胚间充质,具有成纤维细胞的形态特征及成骨/成牙骨质细胞表型特征,可将牙囊细胞作为种子细胞用于牙周组织工程的再生研究。     

体外培养人牙囊细胞的生物学特性

目的 研究体外培养的人牙囊细胞的生物学特性.方法 分离18岁人埋伏阻生下颌第三磨牙的牙囊,组织块法进行人牙囊细胞的培养,取不同代数细胞行HE染色观察细胞形态,MTS四唑盐比色法检测细胞增殖活性,茜素红染色定量分析成骨能力.结果 第9代细胞面积比第3代、第6代细胞面积显著增大(P＜0.05);第3、6、9代细胞增殖活性两两比较,差异有统计学意义(P＜0.05);第3代细胞成骨能力明显强于第6代细胞(P＜0.05).结论 随着体外培养代数的增加,人牙囊细胞生物学特征发生明显变化,面积逐渐增大,增殖活性逐渐变缓,成骨分化潜力逐渐减弱.     

人牙囊细胞的分离培养和生物学特性

目的：应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性。方法：分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织，消化法获得人牙囊细胞，HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达，RT—PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达。结果：原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态，有部分一上皮成分混杂，经纯化后可排除；在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中；RT—PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。结论：体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成Ⅰ型胶原的能力；不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白。     

小鼠牙囊细胞的体外分离培养鉴定及异质性研究

目的：建立小鼠牙囊细胞体外分离培养的方法，并对其起源进行鉴定，同时检测其生物学特性．．方法：用1％的胰蛋白酶消化分离7天龄Balb／c小乳鼠的下颌第一磨牙牙胚的牙囊组织进行体外培养，波形蛋白和角蛋白鉴定细胞起源，HE染色观察细胞的形态，Gomori改良钙钴法进行细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase．ALPase)染色，免疫组化法检测细胞Ⅰ型胶原和骨钙素(osteocalcin，OCN)的表达。结果：分离培养的细胞具有多形性，现有3种基本的细胞类型：立方形或多角形；长梭形：非常细长的细胞形状，前2种细胞胞核内有2～4个清晰的核仁，胞质内有大量颗粒，且有大量的线状伪足。波形蛋白染色阳性。角蛋白染色阴性，ALPase染色显示72．7％的牙囊细胞内的ALPase呈强阳性；免疫组化染色显示48．8％的牙囊细胞Ⅰ型胶原及8．75％的牙囊细胞的OCN表达阳性。结论：所培养的牙囊细胞源自间充质，含有多种细胞表型．具有异质性。     

人牙囊细胞的培养及其特性

目的：体外培养人牙囊细胞并研究其特性。方法：取年龄为12岁人埋藏阻生第三磨牙的牙囊，组织块法进行人牙囊细胞的培养，HE染色、扫描电镜观察人牙囊细胞的形态，免疫组织化学染色技术观察I型胶原及波形蛋白在牙囊细胞中的表达及定位。结果：培养的人牙囊细胞呈梭形、卵圆形及多角形，形似成纤维细胞；扫描电镜可见细胞多呈梭形，也可见多角形，所有细胞表面均有颗粒状物质，有的细胞表面多且密，有的细胞表面较少，折光性较强，细胞核周围分布较多；在牙囊细胞中I型胶原和波形蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中，围绕细胞核周围染色较强，细胞核内染色阴性。结论：体外可以培养人牙囊细胞，人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成I型胶原的能力。     

携带RUNX2基因突变的人牙囊细胞的分离培养及鉴定

目的：研究携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞的分离、鉴定及意义。方法：收集颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）患者,鉴定其致病基因RUNX2的突变位点,通过离体培养CCD患者的未萌牙牙囊细胞,检测其携带的基因突变位点,鉴定RUNX2＋/m牙囊细胞。结果：全血基因组测序结果发现,患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变,该突变型为c.309_310insTG,成功分离培养及鉴定RUNX2＋/m牙囊细胞,并发现RUNX2基因突变减少了牙囊细胞中此蛋白的表达水平。结论：成功分离培养携带RUNX2基因突变位点的人牙囊细胞,为进一步研究RUNX2基因在牙囊及牙齿萌出中的作用提供实验模型。     

大鼠牙囊细胞体外培养技术的建立及其鉴定

目的　建立体外培养大鼠牙囊细胞的方法,观察牙囊细胞体外生长的生物学特性。方法　分离乳鼠下颌第一、第二磨牙牙胚的牙囊组织,应用组织培养的方法进行牙囊细胞原代和传代培养。显微镜观察培养细胞的形态,电镜观察体内牙囊组织和体外培养的牙囊细胞的超微结构。免疫组化法检测细胞波形蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结果　分离组织培养24 h后,梭形细胞和多角形细胞从组织块中游出,经消化排除法获得纯化的牙囊细胞。显微镜下牙囊细胞为成纤维细胞样,电镜下牙囊细胞无桥粒,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网(RER)。免疫组化染色显示牙囊细胞表达波形蛋白、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白。结论　运用组织培养和细胞生物学技术可以成功获得原代和传代培养的大鼠牙囊细胞,体外培养的细胞具有与正常大鼠牙囊细胞相一致的生物学特性。     

体外培养的人牙髓细胞表型分析

目的：分离培养来源于人体的牙髓细胞并对其细胞表型进行分析。方法：采用组织块法培养人牙髓细胞,根据牙髓的细胞成分选择特异性抗体,利用免疫组化技术对其细胞表型进行分析。结果：Ⅲ型胶原在体外培养的牙髓细胞中广泛表达,ON和OPN表达也较广泛,阳性细胞呈星形,伸出多个胞浆突起互相连接;α-平滑肌肌动蛋白和CD34表达细胞为集落状,前者呈细长的梭形,后者呈圆形;Ⅰ型胶原、BSP和OC仅在少量细胞中表达,且细胞形态不规则;DSP、NF、CD14及CD45均为阴性。结论：体外培养的人牙髓细胞表型呈现多样性,表达平滑肌、内皮细胞及骨的标志物。     

小鼠牙囊细胞的体外培养及表型特征

目的　建立小鼠牙囊细胞(DFC)的体外分离培养方法,研究牙囊细胞的表型特征。方法　用1%的胰蛋白酶消化分离9 d龄Balb/c小鼠的下颌第一磨牙牙胚的牙囊组织进行体外培养,倒置显微镜下观察细胞的形态,扫描电镜观察细胞的表面形貌,SP免疫组化法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)的表达。结果　分离培养的细胞有3种类型:立方形或多角形;长梭形;非常细长的细胞形状。扫描电镜下细胞具有多形性,有大量的线状胞浆突和微绒毛;根据细胞表面有无纤维细丝覆盖,可将细胞分为有纤维细丝、无纤维细丝两个亚群。免疫组化染色显示部分牙囊细胞的ALP、BSP、OPN的表达阳性。结论　牙囊细胞具有多种细胞的表型特征, 有分化为成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞的潜能。     

体外培养观察人牙囊细胞中细胞程序性死亡及其在不同流体静压力下的变化

目的 研究体外培养的人牙囊细胞的特征,以及在不同流体静压力作用下细胞程序性死亡（PCD）的改变,探讨PCD在牙齿萌出过程中的作用。方法 取12岁男孩埋伏阻生牙齿的牙囊进行人牙囊细胞培养,将传代的培养细胞应用TUNEL的方法标记PCD细胞,分别在50 kPa和100 kPa流体静压力作用1 h后观察PCD变化,以不加压的人牙囊细胞作为对照。结果 体外培养的人牙囊细胞呈梭形、纺锤形或多角形,具有成纤维细胞特征。在50 kPa流体静压力下人牙囊细胞PCD阳性细胞率与对照组无统计学差异（P>0.05）,而100 kPa流体静压力下PCD阳性细胞率较对照组增加了31.65％,有统计学差异（P<0.01）。结论 流体静压力可以影响体外培养的人牙囊细胞的程序性死亡。     

神经营养素3促进人牙囊细胞成骨分化

目的 研究神经营养素3（NT-3）对人牙囊细胞（hDFCs）成骨分化的影响。方法 体外分离并培养hDFCs,免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源,CCK-8法检测不同质量浓度NT-3对hDFCs增殖活性的影响,同时检测NT-3对hDFCs的碱性磷酸酶（ALP）活性,以及骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、骨钙素（OCN）mRNA相对表达量的影响,并用茜素红染色法检测矿化情况。结果 波形丝蛋白和角蛋白染色结果表明hDFCs为间充质细胞来源。NT-3对hDFCs增殖活性无明显影响;当NT-3质量浓度为25、50、100 ng·mL^-1时能明显增强ALP活性,提高BMP-2、OCN mRNA的相对表达量,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）,NT-3质量浓度为100 ng·mL^-1时BMP-2、OCN mRNA的相对表达量达到最高。当NT-3质量浓度为50、100 ng·mL^-1时矿化结节数量最多。结论 适宜质量浓度的NT-3能促进hDFCs的成骨分化。     

低氧对人牙囊细胞生物学特性的影响

目的 研究低氧对人牙囊细胞（hDFCs）生物学特性的影响。方法 利用组织块酶消化法从年轻恒牙中分离培养hDFCs;采用免疫荧光技术检测细胞表面标志物,多向诱导实验检测细胞多向分化潜能;模拟体外低氧微环境,将细胞分为常氧组（20%O₂）和低氧组（2%O₂）,分别对两组细胞行Transwell小室试验检测低氧对细胞迁移的影响,采用CCK-8法检测低氧对细胞增殖的影响。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot分别从基因和蛋白水平检测hDFCs多能性相关标志物于不同氧体积分数下的表达;分别对两组细胞进行成骨诱导,qRT-PCR检测成骨相关基因,茜素红染色评估矿化结节的形成。结果 hDFCs具有较强的干细胞特征,具有成骨、成脂及成神经多向分化能力,符合间充质干细胞基本标准,能够满足牙组织工程构建对种子细胞的需求。低氧有利于hDFCs多能性的保持,同时促进了hDFCs的迁移和增殖。hDFCs于低氧中进行诱导时,其成骨分化能力得到增强。结论 低氧微环境对维持hDFCs多能性,促进hDFCs增殖、迁移和分化有重要作用。     

大鼠牙囊细胞多向分化潜能的体外研究

目的:体外研究用差速贴壁法和有限稀释法纯化的大鼠牙囊细胞(Dental foilicle cells,DF-Cs)的多向分化潜能,为用于口腔组织工程的种子细胞奠定基础。方法:体式显微镜下准确分离7 d龄SD大鼠第一磨牙牙囊组织,使用酶消化法、有限稀释法、差速贴壁法进行培养和纯化细胞,取第3代细胞分别进行以下检测:①流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记;②骨向诱导、成脂诱导、成神经诱导和相关检测。结果:①差速贴壁法和有限稀释法纯化培养的大鼠牙囊细胞大多呈长梭形,部分细胞呈三角形,细胞形态呈现异质性;②流式细胞仪检测结果显示所获得的牙囊干细胞表面标记CD29、CD90阳性率分别为95.6%、98.6%,而CD45的阳性率仅为4.2%;③成骨诱导后,茜素红染色呈阳性,ALP染色显示ALP表达增强明显;成脂诱导后细胞胞浆内可见明显脂滴,油红O染色呈阳性;神经细胞诱导后细胞形态发生明显改变,神经微管蛋白染色呈阳性。结论:体外培养的大鼠牙囊细胞具有较强的多向分化能力,可作为口腔组织工程理想的种子细胞。     

人牙源性上皮细胞的体外培养研究

目的：建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法，为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法：采用组织块法原代培养人牙源性上皮细胞，用更换培养液类型、多次差别消化法和反复贴壁法进行纯化，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，用免疫荧光法检测细胞表达角蛋白和成釉蛋白的情况。结果：原代培养的人牙源性上皮细胞生长良好，但有少量成纤维细胞混杂，经纯化后明显好转，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白及成釉蛋白。传至第5代后，细胞逐渐变为长梭形，失去上皮细胞形态。结论：体外培养的人牙源性上皮细胞在较长时间内可保持其特性，有望作为牙齿组织工程研究的种子细胞。     

地塞米松对体外培养的人牙囊细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的:观察不同浓度地塞米松对体外培养人牙囊细胞增殖及分化的影响.方法:以不同浓度(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L)地塞米松为诱导剂,进行四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测和碱性磷酸酶(ALP)活性检测,评价细胞增殖和分化情况.结果:与空白对照组比较, 低浓度(10-10、10-9 mol/L)地塞米松对牙囊细胞增殖抑制不明显,高浓度(10-8、10-7、10-6 mol/L)的地塞米松明显抑制牙囊细胞的增殖(P<0.01).10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L地塞米松可以增强牙囊细胞碱性磷酸酶的表达,有显著性差异(P<0.01),随着地塞米松浓度增加,碱性磷酸酶活性逐渐增强,不同浓度间具有显著性差异(P<0.05).10-8 mol/l的地塞米松作用于牙囊细胞,其碱性磷酸酶的表达,从第3 d开始升高,第7、9 d达到最高.结论:高浓度地塞米松抑制牙囊细胞的增殖.地塞米松能够升高体外培养的人牙囊细胞中碱性磷酸酶的活性,并呈现剂量依赖性,特定浓度的地塞米松对牙囊细胞碱性磷酸酶活性的影响随时间的延长而升高,呈现时间依赖性.