雷公藤内酯醇对浆细胞样树突状细胞功能及成熟的影响

目的 通过体外试验研究雷公藤内酯醇(triptolide)对浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell,pDC)功能及成熟的影响,为进一步阐明雷公藤内酯醇的免疫学活性提供依据.方法 从健康志愿者外周血分离单个核细胞,流式细胞仪分选pDC,加入0、5、10、30 μg/L的雷公藤内酯醇共孵育,24 h后收集上清液,ELISA检测pDC分泌的IFN-α、IL-6、TNF-α量,5 d后收集细胞,流式细胞仪检测树突状细胞表型CD11c、CD80、CD86阳性率,光镜观察DC的形态,扫描电镜观察DC的超微结构.结果 雷公藤内酯醇显著降低pDC分泌的IFN-α、IL-6、TNF-α,并呈雷公藤内酯醇浓度依赖性(P＜0.05);雷公藤内酯醇可抑制pDC向DC的分化和成熟,并呈雷公藤内酯醇浓度依赖性(P＜0.05).结论 雷公藤内酯醇能够降低pDC的功能,并抑制其向DC的分化和成熟.

Abstract：

Objective To explore the mechanism of immunomodulatory activity of triptolide on healthy volunteers peripheral blood mononuclear cells (PBMC)-derived plasmacytoid dendritic cells (pDCs). Methods Healthy volunteers-derived pDCs were sorted by flow cytometry, then incubated with triptolide (0, 5, 10, 30 μg/L). After 24 hours, we detected the concentration of IFN-α, IL-6, TNF-α using ELISA. After 5 days, the cultrural cells were collected and analyzed by flow cytometry, light microscope and electron microscope scanning. Results Triptolide-treated pDCs secreted lower level of IFN-α,IL-6 ,TNF-α, triptolide could inhibit pDCs differentiation to DCs which displayed more immature morphology and immunophenotypes than untreated-pDCs. Conclusion Triptolide could decrease the immune function of pDCs, inhibit differentiation and maturation of pDCs.     

雷公藤内酯醇对系统性红斑狼疮患者DC细胞功能及成熟的影响

目的 通过体外实验研究雷公藤内酯醇(triptolide)对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者树突状细胞(dendritic cell,DC)功能及成熟的影响,为进一步阐明雷公藤内酯醇的免疫学活性提供依据.方法 从SLE患者外周血分离单个核细胞,流式细胞仪分选DC,加入0、5、10、30μg/L的雷公藤内酯醇共孵育,24h后收集上清液,ELISA检测IFN-α、IL-6、TNF-α量,5d后收集细胞,流式细胞仪检测DC表型CD11c、CD80、CD86阳性率,光镜观察DC的形态,扫描电镜观察DC的超微结构.结果 雷公藤内酯醇显著减低活动期与非活动期SLE患者IFN-α、IL-6、TNF-α量,并呈雷公藤内酯醇浓度依赖性(P＜0.05);雷公藤内酯醇可抑制SLE患者DC的分化和成熟,并呈雷公藤内酯醇浓度依赖性(P＜0.05).结论 雷公藤内酯醇能够减弱SLE患者DC的功能,并抑制其分化和成熟.     

树突状细胞上调MHC Ⅰ类相关抗原A表达对NK细胞活性的影响

目的:观察单核细胞、未成熟和成熟树突状细胞(DCs)表达MHC Ⅰ类相关抗原A(MICA)的情况,以及DCs表达MICA后对NK细胞活性的影响.方法:用流式细胞术分别检测单核细胞、未成熟DC(iDCs)以及LPS、TNF-α、CD40L、IL-15和IFN-α分别刺激的成熟DCs表面MICA的表达,并观察DCs表达MICA后对NK细胞表达CD69、细胞毒活性和分泌IFN-γ的影响.最后用流式细胞术检测重组NKG2D/Fc蛋白和抗IL-12单克隆抗体(mAb)对DCs激活NK细胞的影响.结果:单核细胞不表达MICA,iDCs低表达MICA.LPS、TNF-α和CD40L对DCs表达MICA无影响;但IFN-α和IL-15可促进DC上调MICA表达.DCs表达MICA后可促进NK细胞表达CD69、分泌IFN-γ、杀伤K562细胞.NKG2D/Fe蛋白可抑制NK细胞的杀伤活性和分泌IFN-γ;而抗IL-12mAb仅抑制IFN-γ分泌.结论:MICA在DCs表面的表达受局部微环境影响,且DCs表达MICA后可增强NK细胞的活性.     

慢性乙肝患者树突状细胞对Th1/Th2分化的影响

探讨慢性乙肝患者树突状细胞(dendritic cells,DC)对CD4+Th细胞亚群分化的影响。分离慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC),以rhIL-4(50 ng/ml)、rhGM-CSF(10 ng/ml)和rhTNF-α(100 u/ml)诱导培养DC。以流式细胞仪检测DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子表达情况。MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞亚群,PMA+Ionomycin刺激后胞内荧光染色,流式细胞仪检测辅助性T细胞(helper T cell,Th)内特征性细胞因子IFN-γ/IL-4以判断Th1/Th2分化。ELISA法检测DC或Th细胞培养上清中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-4的含量。结果:慢性乙肝患者的DC表达CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子水平明显低于正常人(P<0.01);培养至第7天,慢性乙肝患者DC分泌的IL-12水平低于正常人(P<0.01),而分泌的IL-6水平增高(P<0.05)。与正常人相比,慢性乙肝患者外周血中Th1细胞占CD4+T细胞的百分比较低(P<0.01),其Th细胞培养上清中IFN-γ的量也较低(P<0.01)。患者DC与同种异体的健康人Th细胞共培养,刺激Th1型细胞因子IFN-γ产生的能力低于正常人(P<0.01)。慢性乙肝患者体内DC功能的异常可能导致了外周血Th1细胞分化不足。     

褐藻多糖硫酸酯体外诱导树突状细胞成熟

目的探讨清道夫受体A(SR-A)非脂蛋白配体,褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan),对人体外培养的单核诱导的树突状细胞(monocyte derived DC,MDDC)的影响及其机制。方法采用免疫磁珠法,直接分离外周血单核细胞并通过GM-CSF,IL-4诱导生成MDDC,经Fucoidan或LPS刺激后,用流式细胞技术(FCM)检测树突状细胞表面协同刺激分子表达及细胞吞噬能力的变化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测MDDC及Th细胞分泌的细胞因子;CFSE法检测经刺激后MDDC对Th细胞活化、增殖的影响。结果经流式细胞分析术检测,Fucoidan刺激后的MDDC膜表面CD80、CD83及MHC-Ⅱ分子的表达均增强,其中CD83分子表达上调呈剂量依赖性,同时MDDC吞噬能力减弱;IL-10,IL-12p40和TNF-α的分泌增加;并且可以诱导Th细胞的分泌IFN-γ并诱导其增殖。结论 Fucoidan在体外可以诱导MDDC的成熟、活化,刺激其分泌相关细胞因子,发挥其免疫应答中抗原呈递,促进Th活化、增殖分化的作用;通过该作用阐明Fucoidan及SR-A在DC的活化和成熟过程中的作用。     

白细胞介素-18干预诱导的树突状细胞表型和活性研究

目的：研究白细胞介素-18（IL-18）干预诱导的树突状细胞（DC）的表型和活性。方法:自人外周血单核细胞诱导DC，第5 d起分为IL-18组、TNF-α组和IL-18+TNF-α组，分别加IL-18、TNF-α及IL-18+TNF-α促成熟，用ELISA法测定上清中IL-12含量；用流式细胞仪测定培养8 d DC的CD1a、HLA-DR、CD83及CD86的表达；用MTT法检测3组DC诱导T细胞增殖的作用。用ELISA法测定3组DC刺激T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)的量。结果:IL-18组与TNF-α组CD1a、HLA-DR、CD83及CD86表达无差异，IL-18+TNF-α组CD1a、CD83及HLA-DR阳性率高于IL-18组。IL-18+TNF-α组IL-12量高于IL-18组和TNF-α组(P＜0.05)。IL-18组与TNF-α组DC刺激T细胞增殖作用无差异，IL-18+TNF-α组DC的作用强于IL-18组和TNF-α组。IL-18组和TNF-α组IFN-γ量无显著差异，IL-18+TNF-α组IFN-γ的量高于IL-18组和TNF-α组(P＜0.05)。结论:IL-18干预诱导的DC高表达表面分子，具有明显的免疫刺激活性，IL-18与 TNF-α合用作用更强。     

TLR2激动剂Pam3CK逆转IL-10转染小鼠髓样树突状细胞免疫功能的研究

目的:观察TLR2激活剂Pam3CK对IL-10转染小鼠髓样树突状细胞免疫功能影响。方法:转染IL-10至小鼠髓样树突状细胞(mDC),TLR2配体Pam3CK刺激48小时,利用流式细胞仪检测DC表面标志MHCⅡ、CD80、CD86及FasL等分子的表达;ELISA检测细胞产生IL-6、TNF-α。结果:IL-10抑制mDC表达CD80、CD86、MHCⅡ类分子,降低其分泌IL-6、TNF-α,促进其表达FasL,而TLR2激动剂刺激增加了IL-10转染DC表达MHC-Ⅱ类分子及CD80、CD86,促进其产生IL-6及TNF-α,抑制了FasL表达。结论:TLR2激动剂可逆转IL-10诱发的DC免疫应答低下。     

MCF-7 乳腺癌细胞培养上清对树突状细胞抑制作用的研究

目的:应用MCF-7乳腺癌细胞分泌的上清液培养正常外周血树突状细胞,探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌因子对正常树突状细胞分化、成熟及功能的影响.方法:应用MCF-7 乳腺癌细胞的培养上清和GM-CSF、IL-4及TNF-α培养正常外周血单个核细胞,检测所诱导的树突状细胞(DC)及其致敏的CTL活性.结果:MCF-7 乳腺癌细胞培养上清能够明显抑制正常树突状细胞的分化成熟及抗原提呈能力,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达明显降低,与正常对照差异显著(P＜0.01);CTL对MCF-7细胞杀伤活性为17.35%与对照组56.14%比较差异显著(P＜0.01);IL-12分泌和共刺激T淋巴细胞所分泌的IFN-γ明显降低(P＜0.01).结论:MCF-7 乳腺癌细胞上清明显抑制所共培养的树突状细胞的分化、成熟及抗原提呈能力.     

TGF-β1对单核细胞来源的树突状细胞表型和功能的影响

目的:研究 TGF-β1对树突状细胞(DC)的分化、成熟及功能影响.方法:应用100万U/L粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)7 d诱导单核细胞分化为不成熟DC,加入终浓度20万U/L的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)48 h后获得成熟DC的体外模型,将TGF-β1加入该模型中,用流式细胞术分别检测DC分化,成熟阶段细胞表型的变化,应用ELISA检测DC IL-12的分泌水平,应用MTT法检测DC刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果:TGF-β1对不成熟DC的特征性分子 CD1a的表达无明显影响,但在诱导DC的成熟阶段,TGF-β1明显抑制CD40、CD86及CD83上调.此外,TGF-β1显著减少DC IL-12的分泌,显著抑制DC刺激同种异体T 细胞增殖的能力.结论:DC是TGF-β1免疫抑制活性的靶细胞.TGF-β1不影响DC的分化,但抑制DC的成熟和细胞因子的分泌,降低DC刺激同种异体反应T细胞增殖的能力.     

Bryostatin-1调节TNF-α激活的树突状细胞免疫功能

目的探讨Bryostatin-1对树突状细胞(DC)免疫功能的调节作用。方法联合应用GM-CSF和IL-4自人外周血单核细胞定向分化DC;以Bryostatin-1刺激TNF-α诱导成熟的DC,收集DC及其上清夜,以FACS和ELISA方法分析DC表面免疫分子(CD80、CD83、CD86、HLA-DR和B7-H1)和细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-10和IL-12)表达水平;自DC提取RNA,以Northern blot分析DC的B7-h1 mRNA表达水平;以DC为诱导细胞,进一步检测DC的免疫诱导功能。结果Bryostatin-1通过降低DC表面B7-H1表达和增强B7.2表达,以及调节DC细胞因子(IL-1b、IL-12和IFN-γ)分泌,增强DC的免疫诱导功能,PKC通道特异性的抑制剂BI明显逆转Bryostatin-1的上述作用。结论Bryostatin-1增强DC免疫功能,其机制可能是激活PKC通道。