IL-1β激活后的许旺细胞与人发角蛋白三维培养构建人工神经桥接体

目的 探索白细胞介素-1β（IL-1β）激活后的许旺细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体,修复神经缺损.方法 体外培养纯化的许旺细胞经IL-1β激活前、后与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处.S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白共培养情况,原位杂交法观察人发角蛋白降解及神经生长因子（NGF）在坐骨神经内的表达,移植术4周后检测坐骨神经功能指数.结果 经IL-1β激活后的许旺细胞能更好地黏附于人发角蛋白表面,进行分裂、增殖.3～4周,桥接体内的人发角蛋白开始降解,其周围可见IL-1β激活后的处于增殖分裂期的许旺细胞NGF表达强阳性,坐骨神经功能恢复时间提前.结论 经IL-1β激活后的许旺细胞与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白复合培养构建成人工神经桥接体,具有修复神经缺损的同时还能够加速坐骨神经损伤后功能的恢复.     

甲泼尼龙对体外培养许旺细胞分泌神经生长因子的研究

目的研究甲泼尼龙对体外培养许旺细胞分泌神经生长因子的促进作用。方法体外培养兔许旺细胞,纯化后的细胞配成单细胞悬液,按5×10^4个／孔的细胞数量接种于预先铺过明胶的4孔培养板中。根据加入药物浓度随即分成四组：A组,空白对照组;B组,加入0．1mg／L甲泼尼龙;C组,加入1．0mg／L甲泼尼龙;D组,加入5．0mg／L甲泼尼龙。分别于加药后第2、4、6、8、10天吸取培养液做NGF、CNTF、GDNF定量测定。结果①B、C、D组许旺细胞生长速度明显快于A组,三种神经生长因子分泌量明显多于A组,差异有统计学意义（P〈0．01）,B、C、D组之间差异无统计学意义（P〉0．05）;②NGF的检测结果有优于CNTF、GDNF的趋势（P〈0．01）,CNTF和GDNF的促分泌情况差异无统计学意义（P〉0．05）。结论甲泼尼龙能促进体外培养许旺细胞的增殖和神经生长因子的分泌。小剂量应用和大剂量应用差异无统计学意义。     

EDTA法纯化成年大鼠许旺细胞的实验研究

目的 探讨乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EDTA)纯化成年大鼠许旺细胞的可行性。方法 取SD成年大鼠的双侧坐骨神经,高倍显微镜下剥除神经外膜及束膜。复合胶原酶NB4消化30min,600g离心去除上清液。加入含神经生长因子的培养液,置于细胞培养箱中预变性1周。胰蛋白酶消化预变性的神经获得原代细胞。培养至亚融合状态,EDTA-PBS溶液作用3min,显微镜下观察许旺细胞的变化。离心去上清,加入许旺细胞培养液悬浮,种植于培养瓶,置于培养箱培养。培养至亚融合,P75免疫荧光法检测许旺细胞的纯度。结果 通过两次EDTA法纯化,许旺细胞纯度已经达到99%以上。结论 EDTA可以高效纯化成年大鼠的许旺细胞。     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的探索神经膜（旧称许旺细胞）与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法用10μmol／ml BrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人T神经桥接体，移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋门免疫组化染色鉴定许旺细胞，倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养．石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长，移植入神经缺损处4周后，坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解．黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养．构建成人工神经桥接体．填补神经缺损。     

脉络丛上皮细胞改良体外纯化培养及其分泌神经再生相关因子的特点

目的 探讨脉络丛上皮细胞(CPECs)的体外纯化培养方法及其分泌脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)的特点.方法 取SD新生大鼠侧脑室脉络丛,分离CPECs并进行传代培养及纯化,采用免疫荧光化学法进行CPECs鉴定.将CPECs分为原代培养组(A组)、传1代培养组(B组)及传2代培养组(C组),并检测各组BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA及蛋白的表达情况.结果 经荧光显微镜鉴定,所获细胞均为CPECs.BDNF、GDNF的mRNA及蛋白在A组、B组及C组均有表达,B组及C组的表达均较A组降低,C组的表达较B组低(P ＜0.05);NGF、CNTF的mRNA及蛋白在A组、B组及C组也均有表达,B组及C组的表达较A组增加,C组的表达较B组低(P＜0.05).结论 改良体外纯化培养CPECs方法可行.CPECs体外具有分泌BDNF、NGF、CNTF和GDNF的能力,而且具有一定周期规律性.     

联合应用NGF和CNTF对大鼠坐骨神经损伤后功能恢复的影响

目的 探讨联合应用神经营养因子（Nerve growth factor,NGF）和睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophic factor,CNFT）对大鼠坐骨神经损伤后再生及功能恢复的影响。方法 用硅胶管桥接120只大鼠左侧坐骨神经长6mm缺损，随机分为4组，分别行NGF＋CNTF、CNTF、NGF、生理盐水（NS）靶肌肉注射。术后行坐骨神经功能指数（SFI）、电生理检测、病理学检查。结果 联合应用NGF和CNTF组SFI恢复率、各项电生理及轴突图像分析指标明显优于单独用药组。结论 联合应用NGF和CNTF可明显促进大鼠坐骨神经损伤后再生与功能恢复。     

外源性NGF对坐骨神经损伤后脊髓前角细胞CNTF表达的影响

目的　探讨坐骨神经损伤后脊髓前角细胞睫状神经营养因子 (CNTF)表达变化及外源性神经生长因子(NGF)与CNTF表达的关系。方法　采用大鼠坐骨神经损伤动物模型 ,分为给药组和对照组 ,每只大鼠又分为损伤侧组 (L组 )和健侧组 (R组 )两个亚组。用原位杂交、免疫组化技术检测CNTF的表达水平 ,观察各组在 1d、7d、1 4d、2 1d及 2 8d时的变化。用计算机图像自动处理系统进行定量分析研究。结果　给药组损伤侧脊髓前角细胞中CNTF表达水平除 1d、7d组外其余均多于对照组 (P <0 .0 5 ) ;而两组健侧脊髓前角细胞中CNTF表达水平无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论　①外源性NGF能促进坐骨神经损伤后损伤侧脊髓前角细胞中CNTF表达水平的增加 ;而对健侧CNTF表达水平无明显作用。②坐骨神经损伤后损伤侧脊髓前角细胞中CNTF表达水平在最初的 3周内逐渐下降 ,然后开始恢复 ,但至第 4周尚未恢复到开始时的水平 ;而两组健侧CNTF表达水平则无明显差异 (P >0 .0 5 )。     

神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的 探索神经膜(旧称许旺细胞)与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法 用10μmol/mlBrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养,石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果 体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长,移植入神经缺损处4周后,坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解,黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论 许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养,构建成人工神经桥接体,填补神经缺损。     

促红细胞生成素对大鼠坐骨神经损伤后背根神经节细胞Bcl-2和Bax表达的影响

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)对大鼠坐骨神经损伤后背根神经节细胞Bcl-2和Bax表达的影响及其作用机制,为周围神经损伤的临床治疗提供实验依据.方法 ♀ SD大鼠36只,制备大鼠左侧坐骨神经缺损模型,随机分为3组:EPO组、神经生长因子(NGF)组和生理盐水(NS)组.3组分别腹腔注射EPO、NGF和NS.术后第7...     

电针对坐骨神经损伤大鼠BDNF、NGF和GAP-43表达的影响

目的 观察电针对大鼠坐骨神经损伤的保护作用,探究其作用机制。方法 取雄性SD大鼠,随机分成假手术组、模型组、电针组。除假手术组外,其他各组采用钳夹法复制坐骨神经损伤模型,2 d后对电针组大鼠“足三里”和“环跳”进行电针治疗,7 d为1个疗程,共治疗2个疗程,并分别在7 d和14 d对大鼠坐骨神经功能进行评价,治疗结束后,采用免疫组织化学法对坐骨神经中脑源性神经营养因子（brain derived nerve growth factor,BDNF）、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和生长相关蛋白-43（growth associated protein-43,GAP-43）进行检测,同时在光镜下观察坐骨神经的病理变化。结果 与模型组比较,电针组大鼠坐骨神经功能指数（sciatic nerve function index,SFI）明显增加,最大诱发电位和神经传导速度（nerve conduction velocity,NCV）明显加快,潜伏期明显缩短。病理检查显示电针组神经纤维排列相对整齐,空泡样变性减少,可见到施万细胞的增殖。坐骨神经中BDNF、NGF和GAP-43表达明显上调。结论 电针治疗能促进大鼠坐骨神经损伤修复,可能与其上调BDNF、NGF和GAP-43表达有关。     

成年兔雪旺细胞体外培养增殖和纯化的实验研究

目的探讨从成年大白兔周围神经体外分离、纯化、培养的条件，观察雪旺细胞在体外存活、生长情况，目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，寻找一种较好的获取雪旺细胞的方法。方法利用成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经，剪碎至1mm的植块，经改良后反复差速贴附法进行培养，应用b-FGF刺激SC增殖；采用相差显微镜下观察雪旺细胞状态计数和S-100细胞免疫组化染色相结合鉴定；绘制生长曲线，按照细胞倍增时间公式计算其倍增时间。结果采用发生Wallerian变性后的兔双侧坐骨神经，经改良后差速贴壁培养方法能够明显抑制成纤维细胞的生长，但对雪旺细胞的生长影响较小，可获得大量高纯度的雪旺细胞，经S-100蛋白免疫组化鉴定，雪旺细胞纯度达94％以上，细胞数量达1×10^6／mL以上；绘制其生长曲线，并计算得出体外培养的第三代雪旺细胞体外倍增时间为3d；一定浓度的b-FGF和NGF可促进雪旺细胞的增殖。结论①联合采用发生Wallerian变性后的神经、改良差速贴壁培养、b-FGF和NGF促进雪旺细胞增殖是一种较经济、简便、实用的方法，可获得较高纯度的雪旺细胞。②本培养方法能够获得大量高纯度的雪旺细胞，可作为周围神经组织工程实验研究的细胞来源。     

NGF,CNTF和CGRP在人周围神经再生过程中的表达与分布

本研究以５例成年人正中神经切割伤后２－３个月的神经为材料，取损伤处的近侧端与远侧端，４％多聚甲醛固定，冰冻切片，切片分别与特异性抗体孵育，兔抗ＣＮＴＦ、小鼠抗ＣＧＲＰ和小鼠抗ＮＧＦ，显色反应采用兔疫酶组化的ＡＢＣ系统。     

神经生长因子对2,5-己二酮中毒性大鼠周围神经病的治疗作用

目的探讨神经生长因子（NGF）对2,5-已二酮（2,5-HD）诱导的大鼠中毒性周围神经病的疗效。方法大鼠给予2,5-HD间隔灌胃37d成功诱导模型后,肌肉注射NGF1000、2000、4000 BU/（g.d）,治疗11d,正常组和模型对照组给予相同剂量的生理盐水,评估神经病体征损伤评分（姿态、步态和肌力变化）、后肢电生理学检查和坐骨神经的组织病理学检查。结果与正常组比较,2,5-HD模型对照组大鼠的肢体运动功能明显恶化,神经-肌肉动作电位潜伏期显著延长,动作电位幅度显著降低。2,5-HD中毒引起大鼠坐骨神经的组织病理学改变,主要包括轴突的肿胀变性和髓鞘壁的肿胀,NGF肌肉注射后可促进大鼠肢体运动功能的恢复、缩短因中毒所致大鼠坐骨神经-肌肉电潜伏期的延长、纠正神经-肌肉动作电位幅度下降、逆转神经轴索变性、加速损伤神经纤维功能和形态的复原。结论NGF肌肉注射可明显改善2,5-HD诱发的大鼠中毒性周围神经病,为临床应用NGF治疗正己烷中毒性神经病提供理论依据。     

促红细胞生成素对脑出血神经生长因子表达的影响

目的研究促红细胞生成素(EPO)对脑出血后神经功能缺损、细胞凋亡及神经生长因子表达的影响。方法用立体定向技术,将自体不凝血注入大鼠尾状核区制备脑出血模型。110只Wistar雄性大鼠,随机分成四组:正常组、假手术组、ICH对照组、rhEPO治疗组。应用免疫组化及原位细胞凋亡检测脑出血灶周组织NGF、BDNF表达及凋亡细胞。统计学方法采用t检验和LSD-t检验。结果与对照组比较,rhEPO治疗后48～168 h大鼠神经行为学评分明显减少(P0.05)。ICH对照组及rhEPO治疗组术后6h血肿周围皮质TUNEL、NGF、BDNF阳性细胞明显增加,72h达到高峰,120h下降,各时间点与假手术组比较差异有显著性(P0.01)。rhEPO治疗组TUNEL阳性细胞数明显少于同时点ICH对照组(P0.01),但NGF、BDNF阳性细胞数明显增加(P0.01)。结论凋亡机制参与脑出血后继发性损伤过程,EPO能促进神经元BDNF、NGF的表达,对脑出血后神经损伤起保护作用。     

神经生长因子在颅脑损伤救治中的应用

目的观察神经生长因子（NGF）在颅脑损伤救治中的临床疗效。方法脑外伤患者60例,分为两组,对照组30例,予以常规治疗;NGF组30例,在对照组的基础上应用NGF（≥9000AU）,静脉滴注,间隔12h给药,连续给药28d。在治疗结束后及3个月后分别进行格拉斯哥预后（COS）评分,并进行统计学分析。结果NGF组的GOS评分方面明显优于对照组（P〈0．05）,静脉给药未见不良反应。结论NGF可以促进脑功能的恢复,提高颅脑损伤救治的临床疗效;静脉给药是一种安全的给药方式。     

施万细胞高效体外传代培养的实验研究

目的探讨获取大量高纯度施万细胞（SC）的体外培养纯化方法。方法取6-7 d SD乳鼠坐骨神经,立体显微镜下机械性剥除神经外膜与束膜,采用低浓度胰酶消化法和差速贴壁法去除成纤维细胞,阿糖胞苷与G enetic in联合应用进行SC纯化,牛脑垂体提取物（BPE）促进SC增殖。结果经形态学及S-100蛋白相关抗原免疫细胞化学染色鉴定证实所获得的SC状态良好,纯度较高,可达96%以上。结论本方法可以体外获取大量、高纯度的SC,为神经组织工程的研究奠定了实验基础。     

神经生长因子对超低温冷冻异体神经移植的效果评价

目的研究神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对超低温冷冻处理后的同种异体神经移植后神经再生的作用。方法选择Wistar大鼠作为动物模型,于建立动物模型三周前取5只大鼠作为供体,切取双侧坐骨神经,冷藏于-196℃液氮中。另取30只大鼠分为：A组,单纯冷冻异体神经移植组;B组,冷冻异体神经局部应用NGF缓释膜组;C组,自体神经移植组。术后12周进行大体观察、组织学、超微结构等测定。结果术后12周内,三组大鼠均未发生急性移植排斥反应。组织学、超微结构测定发现B、C组神经生长情况明显优于A组。结论超低温冷冻异体神经移植局部应用神经生长因子能更有效促进神经再生。     

成年大鼠周围神经损伤后远侧端雪旺细胞变化的体外研究

目的:体外观察大鼠坐骨神经损伤不同时间段远侧端雪旺细胞的变化。方法:切断成年SD大鼠坐骨神经,以远侧端为研究对象,术后1、2周和1个月取材,进行雪旺细胞体外培养,倒置相差显微镜,S-100免疫荧光染色及激光扫描共聚焦显微镜观察雪旺细胞的形态,MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期。结果:神经被切断后,雪旺细胞形态发生改变,1月组最明显;细胞活力和增殖能力也发生变化,切断1周组活力和增殖能力最强,随后逐渐变弱。结论:周围神经损伤后雪旺细胞形态发生变化,细胞的活力和增殖能力随着时间的推移逐渐下降但仍未停止增殖。