外源性神经生长因子对血肿灶周神经元再生的影响

目的:观察神经生长因子作用下血肿灶周神经元再生状况。方法:实验于2003-03/2004-04在河北医科大学第二医院影像科分子影像学实验室完成。健康家犬21只,随机分为3组:神经生长因子组(n=9):注血后0.5h,将神经生长因子2000AU立体定向导入血肿灶周区。脑出血对照组(n=6):只注血,不注药。对照组(n=3):只进针,不注血和注药。3组动物进入实验程序后前3d进行BrdU标记,在脑出血后3,10,28d3个时间点进行激光共聚焦显微镜检测,观察血肿灶周BrdU荧光单标和BrdU-NSE及BrdU-GFAP荧光双标细胞的数目和所在位置(BrdU为新生神经元的标记物,NSE为成熟神经元的标记物,GFAP为成熟星形胶质细胞的标记物)。结果:实验动物21只均进入结果分析。①新生神经元数目:神经生长因子组3,10,28d时BrdU单标阳性细胞数多于脑出血对照组(2.31±0.24,9.52±1.87,4.43±0.56;0.12±0.14,3.85±1.87,1.41±0.32,P<0.05),10和28d时BrdU-NSE和BrdU-GFAP双标阳性细胞数明显多于脑出血对照组(BrdU-NSE:3.84±0.24和6.23±1.92,1.35±0.71和1.39±0.24;BrdU-GFAP:4.51±2.08和10.53±2.47,1.65±0.08和1.37±0.13,P<0.05);神经生长因子组10d时BrdU单标阳性细胞数最多,28d时BrdU-NSE和BrdU-GFAP双标阳性细胞数明显增多。②新生神经元分布:神经生长因子组双标细胞的分布多位于血肿靠近额叶皮质面,在皮质与皮质下移行区内可见双标细胞,而脑出血对照组极罕见。结论:外源性神经生长因子立体定向导入血肿灶周区,能够通过刺激额叶皮质内源性神经干细胞再生、迁徙和分化的机制,促进血肿灶周神经功能的修复。     

外源性神经生长因子在脑血肿灶周围组织中的表达及对神经功能恢复的影响

目的：观察外源性神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在血肿灶周组织中的表达及其对神经功能恢复的影响，为脑出血基因治疗提供理论依据。方法：健康家犬24只，随机分为3组：NGF组12只：注血后0．5h，将NGF2000AU立体定向导入血肿灶周区；脑出血组8只：只注血，不注药；对照组4只：除麻醉外，不注血和注药。在脑出血后1．3，10．28d四个时间点进行以下检测：①Purdy评分：观察临床神经功能恢复情况。②NGF检测：采用免疫组化SP法。以细胞胞浆呈棕黄色着色为阳性细胞，检测外源性NGF在血肿灶周脑组织中的有效表达。结果：①Purdy评分：NGF组1，3d评分与脑出血组比较差异无显著性意义(P&;gt;0．05)，但10，28d评分[(2．84&;#177;1．53)分，(2．15&;#177;1．13)分]显著好于脑出血组[(3．74&;#177;1．08)分，(3．32&;#177;1.46)分](P&;lt;0．05)。②NGF在血肿灶周组织中的表达：NGF组血肿灶周免疫阳性细胞3d时大量出现，染色较深。持续10d，而脑出血组表达量少且持续时间短(P&;lt;0．05)。结论：外源性NGF立体定向导入血肿灶周区，能够在血肿灶周组织中有效表达，且能明显促进脑出血后神经功能的恢复。     

神经生长因子对脑出血血肿灶周神经元和神经胶质细胞的影响

目的 探讨神经生长因子（NGF）对脑出血血肿灶周神经元和神经胶质细胞的影响。方法 健康家犬28只．随机分为两组：NGF组（n=20）：注血后0．5h，将NGF 2000 AU立体定向导入血肿灶周区；脑出血（ICH）组（n=8）：只注血，不注药。在ICH后1、3、10、28d四个时间点进行以下检测：①采用Purdy评分观察临床神经功能恢复情况。②采用免疫组化SP法，检测外源性NGF在血肿灶周脑组织中的有效表达。③激光共聚焦显微镜检测血肿灶周神经元烯醇化酶（NSE）、神经纤维酸性蛋白（GFAP）荧光单标阳性细胞的数目。结果 ①1～3d Purdy评分两组比较无显著性差异（P〉0．05），但10～28d评分NGF组显著好于ICH组（P〈0．05）。②NGF组血肿灶周免疫阳性细胞3d时大量出现，染色较深。持续10d，而ICH组表达量少且持续时间短（P〈0．05）。③NGF组激光共聚焦显微镜下NSE、GFAP单标阳性细胞数均明显多于ICH组（P〈0，05）。结论 外源性NGF立体定向导入血肿灶周区，早期能够通过保护神经元提高存活率；晚期能够通过促进胶质细胞适度增生、神经纤维生长来促进血肿灶周神经功能的修复。     

涤痰汤对脑出血大鼠神经元线粒体内细胞色素C释放的影响

目的：观察大鼠脑出血后血肿周围神经元线粒体内激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶及诱导细胞凋亡的细胞色素C的释放规律以及血肿变化和中药涤痰汤的干预作用。方法：实验于2003-10／2004-03在中南大学中西医结合研究所实验室进行。取健康SD大鼠65只，随机分成4组：正常组（n=5），假手术组（n=20），模型组（n=20），涤痰汤组（n=20），除正常组外，其余3组设4个时间点：6h，1，3,5d，每个时间点5只大鼠。正常组不干预，模型组和涤痰汤组用脑内立体定位注射含0．4U Ⅻ型胶原酶的生理盐水2 μL诱导大鼠脑出血模型，假手术组注入2 μL生理盐水。涤痰汤组大鼠手术清醒后即灌服涤痰汤中药煎液（半夏、南星各12g，橘红7．5g，枳实、赤茯苓各10g，石菖蒲、人参各5g，竹茹3．5g，甘草2．5g）生药2．67g／（kg&;#183;d），模型组和假手术组用蒸馏水灌胃，2mL／次．2次／d。神经元线粒体内细胞色素C的释放情况应用免疫组织化学法检测，不同时间点大鼠脑内血肿的最大直径用直尺测量。结果：65只动物均进入结果分析。①脑组织细胞色素C阳性细胞计数：正常组未见阳性细胞；假手术组仅于6h，1d时见少数阳性表达细胞，余时间点未见阳性细胞；模型组血肿周围于6h出现阳性表达细胞，1d阳性细胞计数达高峰，3d出现轻度下降，5d明显下降[（12．66&;#177;2．12），（51．74&;#177;2．13），（35．46&;#177;2．84），（17．34&;#177;2．08）个]；涤痰汤组与同时间模型组比较在6h计数无明显差异[（12．68&;#177;2.06）个，P〉0．05]，1,3,5d时阳性细胞减少明显[（50．28&;#177;2．87）,（31．12&;#177;3．05）,（13．18&;#177;2.94）／个，P〈0．05]。②脑血肿的最大直径：正常组和假手术组无血肿形成；模型组造模后于1d达到最大，3d有所变小，5d最小[（4．08&;#177;0．16），（3．58&;#177;0．15），（2．48&;#177;0．15）mm]；涤痰汤组在3d时血肿小于模型组[（3．22&;#177;0．26）mm，P〈0．05]，5d时差距更明显[（1．70&;#177;0．19），P〈0．01]。结论：脑出血后血肿周围的神经元细胞色素C释放明显增多，而且是脑出血的一个早期事件，从脑出血后6h即开始，1d最明显，而后逐渐下降；涤痰汤具有阻止细胞色素C释入胞浆的作用，从而阻断凋亡信号进一步传导，保护脑出血后神经元免于凋亡；同时促进血肿的吸收。     

大鼠脑出血后血肿周围组织活化凋亡蛋白酶3表达与大承气汤的干预

目的：观察大鼠脑出血后血肿周围神经元活化凋亡蛋白酶3的表达和血肿变化，及大承气汤的干预作用。方法：实验于2003-10／2004-03在中南大学湘雅医院中西医结合研究所完成。健康SD大鼠65只随机分成4组，分别为正常组(5只)，假手术组(20只)，模型组(20只)，大承气汤组(20只)。除正常组外，其余3组设4个时间点：6h，1，3，5d。每个时间点5只。采用免疫组化方法检测大鼠脑内血肿周围活化凋亡蛋白酶3的表达，用直尺测量不同时间点大鼠脑内血肿的最大直径。结果：65只大鼠进入结果分析。①活化凋亡蛋白酶3阳性细胞计数：正常组未见阳性细胞表达。造模后模型组血肿周围于6h出现阳性表达细胞．1d阳性细胞计数达高峰，3d出现轻度下降，5d明显下降[模型组：6h(24．600&;#177;2．338)个，1d(115，900&;#177;2．215)个，3d(91．940&;#177;3，177)个。5d(67．900&;#177;2．261)个[。与假手术组比较差异明显[假手术组：6h(3．120&;#177;2．235)个，ld(1．360&;#177;2．097)个，P&;lt;0.01]。大承气汤组与同时间点模型组比较：6h计数无明显差异，1，3，5d均存在明显差异[大承气汤组：1d(114．440&;#177;3．239)个，3d(84．420&;#177;3，648)个，5d(51．460&;#177;3，038)个．P&;lt;0．05或P&;lt;0.01]。②血肿体积变化情况：造模后血肿于1d达到最大，3d有所变小，5d变小明显；大承气汤组在5d缩小程度与模型组比较有明显差异[大承气汤组5d(2．000&;#177;0．187)mm，模型组5d(2．480&;#177;0．148)mm，(t=4．496，P&;lt;0．01)]。但在6h，ld，3d与模型组比较血肿缩小程度差别无显著性意义。结论：大鼠脑出血后血肿周围神经元活化凋亡蛋白酶3表达明显上调；大承气汤能减少活化凋亡蛋白酶3的表达，阻止神经元的凋亡，同时也具有一定的促进血肿吸收的作用。     

黄芪多糖干预实验性脑出血后血肿周围细胞凋亡及核因子κB表达的变化

目的：观察黄芪多糖对大鼠脑出血后神经细胞凋亡及核因子κB表达的影响。方法：实验于2006-01／06在南京医科大学中心实验室完成。①选用健康雄性SD大鼠69只，按随机数字表法分为3组：假手术组、模型组与治疗组，每组23只，每组分别于术后6h，1，3，5d取5只用于病理切片制作，于术后3d每组各取3只用于电镜检查。②模型组与治疗组均采用Ⅶ型胶原酶诱导脑出血模型，假手术组以等量生理盐水代替Ⅶ型胶原酶；治疗组于造模术后2h给予黄芪多糖（美国泛华医药公司Pharmagenesis提供，批号8k01101）25mg／kg腹腔注射，1次／d；其余两组在同样时间点给予2mL生理盐水腹腔注射。③用原位末端标记技术和免疫组化方法检测血肿周围神经凋亡和核因子κB表达的动态变化。④透射电镜观察术后3d血肿周围神经元超微结构的变化。结果：大鼠69只均进入结果分析。①血肿周围神经元凋亡细胞：模型组于术后6h开始增多，为（31．24&;#177;4．55）个／高倍视野。术后1d明显增多，为（72．58&;#177;7．23）个／高倍视野，术后3d达高峰[（159．42&;#177;12．26）个／高倍视野]，术后5d减少[（90．98&;#177;7．65）个／视野]；模型组术后各时间点明显多于假手术组[（1．73&;#177;0．37），（1．45&;#177;0．30），（1．43&;#177;0．32），（1．41&;#177;0．13）个／高倍视野，P〈0．01]。黄芪多糖组术后1，3，5d神经元凋亡细胞为（57．64&;#177;8．45），（132．65&;#177;8．48），（61．23&;#177;7．12）个／高倍视野，少于模型组（P〈0．05-0．01）。②血肿周围核因子κB阳性细胞数：模型组与治疗组术后6h在血肿周围及皮质部位见大量核因子κBp65阳性细胞，术后3d达高峰，术后6h&;#177;5d各时间点均明显高于假手术组（P〈0．01）；治疗组术后6h，1，3，5d为（19．21&;#177;3．87），（44．28&;#177;5．76），（53．29&;#177;5．67），（27．82&;#177;2．74）个／高倍视野，均少于模型组[（26．75&;#177;4．08），（58．33&;#177;8．13），（68．15&;#177;6．89），（37．98&;#177;4．57）个／高倍视野，P〈0．05～0．011。③神经元超微结构：假手术组基本正常；治疗组神经元细胞损伤程度轻于模型组：结论：黄芪多糖可能是通过抑制核因子κB表达来减轻脑出血后的细胞凋亡．对脑出血损伤有神经保护作用。     

外源性雌二醇对脑缺血再灌注损伤大鼠脑源性神经营养因子和神经生长因子表达的影响

目的：观察雌二醇对脑缺血再灌注损伤后具有脑缺血神经元保护作用的脑源性神经营养因子和神经生长因子表达的影响。方法：实验于2002-06／10在郑州大学第一附属医院病理科重点实验室进行。将72只Wistar大鼠随机分为3组：①假手术组（n=8），腹腔注射消毒后的精制玉米油1．5mL，1次／d，连续7d，然后手术，仅分离血管，不栓塞。②模型组（n=32）：给药同假手术组，然后采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。③雌二醇组（n=32）：将17β-雌二醇溶于玉米油中，按100μg／kg腹腔注射，1次／d，连续7d，然后同前造模。假手术组于术后6h，其他两组于再灌注3，6，12，24h处死动物取材（每个时间点8只），采用连续切片免疫组化法检测各组大鼠脑皮质和纹状体区脑源性神经营养因子核神经生长因子表达，以及脑源性神经营养因子神经纤维有无染色。结果：经补充后72只大鼠进入结果分析。①脑源性神经营养因子阳性细胞数：脑皮质：再灌注后6h雌二醇组高于假手术组，但与模型组比较无差异[（78．88&;#177;6．03），（53．75&;#177;3．92），（76．75&;#177;5．87）个／视野]，再灌注12h雌二醇组显著高于模型组[（86．50&;#177;4．24），（63．13&;#177;7．72）个／视野，P〈0．01]。脑纹状体：再灌注6h雌二醇组高于假手术组，但与模型组比较无差异[（63．88&;#177;5．37），（38．75&;#177;4．17），（61．63&;#177;6．39）个／视野]，再灌注12h雌二醇组显著高于模型组[（71.38&;#177;5．29），（48．00&;#177;8．32）个／视野，P〈0．01]。②神经生长因子阳性细胞数：皮质：再灌注6h雌二醇组高于于假手术组[（71．50&;#177;4．50），（45．75&;#177;7．03）个／视野，P〈0．01]，至再灌注12h，显著高于模型组[（79．20&;#177;6．39），（58．63&;#177;4．81）个／视野，P〈0．01]，再灌注24h，仍高于模型组[（69．00&;#177;4．96），（49．25&;#177;5．80）个／视野，P〈0．01]。脑纹状体：3组均为少量表达。③脑源性神经营养因子神经纤维阳性密度：雌二醇组显著高于其他两组（X^2=19．015，25．6，P〈0．01）。结论：给予外源性的雌二醇可以使脑缺血再灌注后内源性脑源性神经营养因子、神经生长因子表达上调，且在再灌注12h内，使大脑半球免于损伤，达到脑保护治疗的作用。     

水蛭提取液对实验性脑内血肿吸收的病理学及动物行为的影响

目的：探索水蛭提取液对实验性脑内血肿吸收的作用。方法：采用成组设计的随机对照研究。脑出血模型用定量胶原酶注入大鼠尾状核来建立，观察水蛭提取液对大鼠神经功能缺损体征评分；血肿容积与血肿周围缺血，血肿周围脑组织水含量及病理改变的影响。结果：①神经功能缺损评分：3d时治疗组(1．96&;#177;0.29)分低于对照组(2．88&;#177;0.33)分(P=0.004)，至第10天时治疗组评分为0，低于对照组(0.94&;#177;0.68)分(P=0.000)。②治疗后6，10d的大鼠脑内血肿治疗组[(15．54&;#177;0.23)，(1．39&;#177;0.39)μL]比对照组[(21．33&;#177;0.39)，(5．69&;#177;0.34)μL]明显缩小(P&;lt;0.05)，同时血肿周围缺血范围治疗组小于对照组，脑水肿比对照组减轻。③水蛭提取液能加快脑出血后的病理组织修复，促进病灶周围血管内皮细胞、毛细血管和胶质细胞增生，无新鲜出血灶发现。结论：水蛭提取液对大鼠脑出血后脑内血肿有治疗作用，而不引起出血并发症。     

外源性神经生长因子在脑血肿灶周围组织中的表达及对神经功能恢复的影响

目的:观察外源性神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)在血肿灶周组织中的表达及其对神经功能恢复的影响,为脑出血基因治疗提供理论依据。方法:健康家犬24只,随机分为3组:NGF组12只:注血后0.5h,将NGF2000AU立体定向导入血肿灶周区;脑出血组8只:只注血,不注药;对照组4只:除麻醉外,不注血和注药。在脑出血后1,3,10,28d四个时间点进行以下检测:①Purdy评分:观察临床神经功能恢复情况。②NGF检测:采用免疫组化SP法。以细胞胞浆呈棕黄色着色为阳性细胞,检测外源性NGF在血肿灶周脑组织中的有效表达。结果:①Purdy评分:NGF组1,3d评分与脑出血组比较差异无显著性意义(P>0.05),但10,28d评分犤(2.84±1.53)分,(2.15±1.13)分犦显著好于脑出血组犤(3.74±1.08)分,(3.32±1.46)分犦(P<0.05)。②NGF在血肿灶周组织中的表达:NGF组血肿灶周免疫阳性细胞3d时大量出现,染色较深。持续10d,而脑出血组表达量少且持续时间短(P<0.05)。结论:外源性NGF立体定向导入血肿灶周区,能够在血肿灶周组织中有效表达,且能明显促进脑出血后神经功能的恢复。     

去松果体大鼠学习能力、大脑皮质胆碱能纤维及一氧化氮合酶的变化

目的：探讨松果体功能减退对大鼠学习能力、大脑皮质胆碱能纤维分布以及一氧化氮合酶表达影响。方法：实验于1997—07／2000—06在珠江医院神经内科实验室完成。选择经Y型迷宫测试学习正常的雄性SD大鼠12只，随机分两组，实验组6只，行松果体摘除术，对照组6只行假手术。①学习能力测试：大鼠学习能力测试用三等分Y型迷宫进行，以大鼠学习尝试次数表示。②采用酶组织化学法测乙酰胆碱酯酶表达，采用SABC法检测神经元型一氧化氮合酶表达。③乙酰胆碱酯酶纤维定量分析：采用Leica Diaplan显微镜及Leica Quantimet 500&;#177;图像分析仪，测量单位面积内乙酰胆碱酯酶的密度，定量参数为每374693．656μm^2内乙酰胆碱酯酶纤维覆盖面积（μm^2）。运动皮质，体感皮质测量第Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ层，海马为CA1，CA2，CA3区的辐状层、腔隙层、分子层和齿状回多形细胞层。皮质神经元型一氧化氮合酶表达以每只大鼠随机取相同部位的3张切片，共计6张切片，光镜下分别随机选右侧皮质、内侧隔核一斜角带核、纹状体、海马区各部位相邻4个视野（&;#215;400），统计神经元型一氧化氮合酶阳性细胞数。结果：纳入动物12只，均进入结果分析。①大鼠学习能力测试：术前实验组大鼠学习能力（14．67&;#177;4．97）次，与对照组（14．33&;#177;4．32）次基本一致（P〉0．05），松果体摘除40d后大鼠学习能力（28．67&;#177;2．42）次，比术前自身对照及术后对照组（13．83&;#177;8．33）次明显下降（P（0．01）。②大鼠大脑皮质中乙酰胆碱酯酶纤维密度测定结果：实验组各部位均比对照组明显降低[实验组运动皮质、体感皮质、海马CA1，CA2，CA3区和齿状回多形细胞层纤维密度分别为（15244&;#177;1339），（14764&;#177;1391），（12991&;#177;970），（15077&;#177;1020），（19546&;#177;1489），（19337&;#177;1378）μm^2，对照组分另4为（21001&;#177;1021），（17930&;#177;2225），（17260&;#177;1342），（18911&;#177;1048），（24108&;#177;1671），（22917&;#177;1909）μm^2，P（0．01]。③不同脑区神经元型一氧化氮合酶表达：实验组大鼠大脑皮质含有较多神经元型一氧化氮合酶阳性细胞数，细胞数为（5．90&;#177;0．68）个，并以体感皮质稍多于运动皮质，多于对照组（3．68&;#177;0．39）个（P＜0．05）；隔核一斜角带核部神经元型一氧化氮合酶阳性细胞数（16．21&;#177;2．03）个，明显多于对照组（9．32&;#177;1．05）个（P＜0．01）；海马部神经元型一氧化氮合酶阳性细胞数（4．27&;#177;0．75）个、纹状体区（9．35&;#177;2．58）个，与对照组（3．94&;#177;0．53）个和（8．96&;#177;2.31）个相比差异无显著性（P〉0．05）。结论：大鼠松果体摘除可以引起大鼠学习能力障碍，其原因可能与大脑皮质、隔核-斜角带核神经元型一氧化氮合酶过度表达，引起一氧化氮神经毒性致胆碱能神经元受损伤有关。