应用凝胶接种技术体外分层构建工程化骨软骨复合组织的初步研究

目的 应用组织工程原理,探索体外构建骨软骨复合组织的关键技术,为移植修复关节骨软骨组织缺损创造条件.方法 采用组织分层构建策略,用兔成骨细胞和羟基磷灰石支架材料,采用凝胶接种技术,体外构建组织工程骨;用兔软骨细胞和聚乳酸/聚磷酸钙纤维支架材料,采用凝胶接种技术,体外构建组织工程软骨;体外培养48 h后,利用界面间凹凸进行压配,并结合蛋白胶粘贴形成工程化骨软骨复合组织;将构建组织移植到裸鼠皮下,以相同大小无细胞复合的支架材料为对照组,术后12周取材进行病理分析.结果 采用凝胶接种技术,在体外可以初步构建组织工程骨和软骨,进而构建工程化骨软骨复合组织;工程化骨软骨复合组织移植到裸鼠皮下,术后12周实验组5例样本在成骨和成软骨区域观察到成骨和成软骨表现,但缺乏正常的钙化层界面结构,而对照组5例未观察到软骨组织形成.结论 采用组织分层构建策略,采用简单的压配技术和新型凝胶接种技术可以在体外初步构建工程化骨软骨复合组织.     

兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外构建组织工程骨的实验研究

目的:研究兔骨髓间充质干细胞(marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)与纳米晶胶原基骨修复材料(nano-hydroxyapatite/collagen,NHAC)体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性.方法:分离兔MSCs体外培养、纯化,取第3代MSCs与NHAC体外复合培养,第5,10 d后扫描电镜(SEM)观察二者复合程度.结果:兔MSCs贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线;兔MSCs与NHAC体外复合培养,在第5,10 d进行扫描电镜观察,发现10 d时粘附于NHAC上的MSCs细胞数(38.52±7.21)明显高于5 d时粘附的细胞数(21.28±4.70),P＜0.01.结论:兔MSCs与NHAC体外复合培养结合程度较高,可以用来构建组织工程骨,为进一步的动物实验奠定基础.     

双相接种法体外构建组织工程骨

目的观察双相接种法构建组织工程骨的效果.方法取健康志愿者骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增、诱导分化,然后应用双相接种技术与脱钙骨基质(DBM)复合构建组织工程骨,并与静置接种方法进行比较,计算接种效率、测定碱性磷酸酶活性,并用倒置显微镜、扫描电镜观察.结果与静置接种法相比,双相接种法不仅获得近100%的接种效率,而且在体外培养过程中,组织块中细胞的碱性磷酸酶活性均高于静置接种法,后者在第14天时碱性磷酸酶活性与前者第5天的水平相当.扫描电镜见双相接种法构建的组织块切面较平坦,孔隙较小,细胞包埋在胶原中,而静置接种法构建的组织块可见细胞,细胞外基质较少.结论双相接种法是一种高效的组织工程骨构建方法,有利于提高接种效率和促进组织工程骨的体外成熟.     

脱钙骨基质支架构建组织工程骨的实验研究

目的以同种异体骨脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)为支架材料,复合体外诱导培养的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),构建组织工程骨并通过裸鼠皮下异位成骨实验及裸鼠皮下致瘤性实验验证其成骨效果及安全性.方法贴壁法培养hMSCs,体外诱导培养扩增,以1.857×106/ml的密度与DBM复合构建组织工程骨,体外培养,并在扫描电镜下观察细胞与材料复合情况,进行组织学观察.同时进行了裸鼠皮下异位成骨实验.结果细胞与支架复合后3 d,细胞与DBM表面及孔隙可实现良好复合;复合后5 d,扫描电镜观察到细胞基质分泌旺盛,充满支架孔隙.裸鼠皮下成骨实验证明其成骨效果良好.结论以本实验中使用的细胞培养方法扩增、诱导分化的种子细胞生物安全性好,自制的DBM具有良好的生物相容性,可为种子细胞生长提供较好的三维空间,按照标准化工艺流程制备的组织工程骨安全、有效.     

异种生物衍生骨与兔骨髓间充质干细胞的体外黏附实验研究

目的:探寻良好的骨组织工程支架材料。方法:以市售新鲜猪股骨制备一种生物骨衍生材料,将材料与兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合培养,扫描电镜下对复合培养过程进行动态观察。结果:异种生物衍生骨具有三维立体多孔结构,并有良好的生物相容性和材料细胞界面。结论:异种生物衍生骨是一种具有临床应用前景、适用于构建组织工程骨的支架材料。     

组织工程化血管内皮细胞种子细胞的研究进展

体外组织工程的主要限制是缺乏足够的血管系统。内皮细胞作为血管和毛细血管结构与功能的重要组成部分,成为构建组织工程化血管的核心,因此组织工程化血管内皮细胞种子细胞的来源成为关键。胚胎干细胞和诱导多能干细胞尽管具有多向分化的潜能,可诱导分化形成血管内皮细胞,但其应用却受到不同程度的限制。而不同来源的间充质干细胞因具备一定的优势逐渐成为组织工程化血管内皮细胞种子细胞的主要来源。     

不同接种密度体外构建组织工程骨的实验观察

目的观察不同接种密度对骨髓间充质干细胞(MSCs)与冻干脱钙骨基质(FDBM)体外构建组织工程骨的影响,以选择适宜的接种密度.方法将不同密度的羊MSCs与同种异体FDBM复合体外构建组织工程骨,通过细胞计数、相差显微镜观察、扫描电镜观察及MTT检测等方法评价细胞在材料中的黏附、生长情况.结果 MSCs在立体网孔结构的FDBM上能较好的黏附、铺展、增殖;接种细胞密度低于2×106/ml时,FDBM上的MSCs附着量随接种细胞密度升高而增加,超过该密度后上架细胞数不再增加,最大上架细胞数为(5.01±0.58) ×104/块(FDBM).结论 FDBM支架上的活细胞数存在一定极限,理想细胞接种密度应该在(1～2)×106/ml.     

利用脱细胞血管基质体外构建小口径组织工程血管

目的 探讨利用犬的间充质干细胞诱导分化种子细胞,以异种脱细胞血管基质为基础体外构建小口径血管移植物.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养的方法从犬骨髓中分离出间充质干细胞并体外培养,诱导分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞;采用非离子型去垢剂和胰蛋白酶去除猪颈动脉血管壁结构细胞,对脱细胞基质进行组织学、力学检测及孔隙率评估.在生物反应器内采用旋转种植的方法将犬骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞种植到脱细胞基质上,体外构建小口径组织工程血管.结果 犬的骨髓间充质干细胞体外能够定向诱导分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,可以作为血管组织工程的种子细胞.经过脱细胞处理后,光镜和电镜观察证实血管壁的细胞成分完全去除.具有良好的孔径和孔隙率.支架在生物力学、孔隙率等方面符合构建组织工程血管支架的要求.在生物反应器内剪切力条件下可以初步构建出组织工程血管.结论 小口径血管移植物可以将间充质干细胞诱导种子细胞,以异种脱细胞血管支架作为基质,在搏动性生物反应器内培养的方法进行构建.     

自体间充质干细胞构建组织工程骨修复人长骨缺损的临床观察

目的观察个体化组织工程骨用以修复患者长骨缺损的疗效与安全性。方法利用组织工程技术,通过抽取临床上骨源缺乏的患者少量骨髓分离出其中的人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell,hMSCs）,并在体外对其进行扩增培养并诱导分化后,与自制的同种异体脱钙骨基质相复合,构建个体化的组织工程骨并应用于临床,通过临床随访其放射学及血液学结果评价其疗效与安全性。结果30例个体化组织工程骨临床应用患者均达到随访半年以上,随访资料显示成骨速度及效果均与自体骨类似,且术后肝肾功、血沉等指标均无明显异常,最长随访达4年未发现病灶复发。结论由患者自体间充质干细胞构建的组织工程骨具有良好的生物安全性和成骨效能。     

小肠黏膜下层复合骨髓间充质干细胞体外构建心肌组织薄片的实验研究

目的 探讨利用小肠黏膜下层（SIS）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外构建心肌组织薄片的可行性。方法 将自大鼠骨髓分离培养的BMSCs经5-氮胞苷（5-Aza）诱导培养3周后种植在经脱细胞处理的SIS浆膜面,在体外动态条件下共培养2周,构建组织工程心肌组织薄片,并进行病理组织学、超微结构和免疫组织化学染色观察。结果 与BMSCs体外共培养2周的SIS经苏木精-伊红（HE）染色显示,细胞在SIS上不只局限于材料表层,呈多层分布,部分细胞逐步向深层迁移和渗透。扫描电子显微镜观察发现,细胞较好地在SIS上黏附、生长和迁移,细胞分泌大量的细胞外基质。免疫组织化学染色结果显示,SIS上的细胞为表达α-actin、cTnⅠ和connexin-43的心肌样细胞。结论 在体外将SIS复合经5-Aza诱导的BMSCs,成功地初步构建出组织工程化心肌组织薄片。SIS是一种良好的心肌组织工程生物支架材料。     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.     

犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养后细胞表型变化

目的: 观察犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)经分离、自然扩增及诱导分化后表型变化和生物学特性. 方法: 利用骨髓穿刺、percoll密度梯度法离心分离继而贴壁筛选纯化BMSCs进行接种培养,体外扩增;倒置显微镜下观察其形态学变化,并进行相关抗原检测. 结果: 分离的细胞免疫组化显示SH2, Vimentin, α-SMA和 collagen Ⅰ, Ⅲ均呈阳性表达,其阳性率分别为(95.1±1.7)%, (64.4±2.2)%, (78.7±0.9)%, (78.3±1.4)%和(66.8±0.8)%;CD34,Ⅷ因子antigen 和laminin的表达均为阴性. 在加入bFGF等诱导培养基作用下,可以诱导分化出成纤维细胞,其诱导分化率为(50.2±2.5)%. 诱导后α-SMA表达阳性率下降为(42.3±1.6)%,vimentin表达阳性率上升为(86.2±2.4)%,生长扩增能力强,2 wk内经3代培养即可扩增到(5.6±0.3)×107细胞数量级. 结论: 此实验自然分化扩增来的肌纤维母细胞的表型和生物学特征显示这类间质细胞较应用bFGF诱导、分化扩增来的成纤维细胞有更强活力,且分泌胶原力强,更符合构建组织工程种子细胞的要求.     

大鼠骨髓间充质干细胞与脱细胞脊髓支架体外共培养

目的 评价脱细胞脊髓支架在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养中的作用,探索最佳接种浓度.方法 分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,诱导BMSCs向神经元样细胞分化.制备脱细胞脊髓支架,将第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养,MTT法检测细胞增殖活性,比较与普通培养的差异;取第3代BMSCs以不同浓度[(0.5、1、2、3、4)×106/mL]接种于支架(脊髓支架修整0.5 cm小段),检测细胞在支架上的粘附率及上架细胞数,建立接种浓度与细胞粘附率、上架细胞数的关系回归方程;扫描电镜观察脱细胞脊髓支架形态以及细胞与支架的粘附情况.结果 成功实现BMSCs的分离及培养,BMSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达,向神经元诱导胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)呈阳性表达;与普通培养相比,BMSCs在支架上细胞增殖活力显著提高(P＜0.05);细胞与支架的粘附率在接种浓度为2×106/mL最高,达到(79.6±2.7)％,单位体积上架细胞数达到(1.364±0.047)×106/cm3;扫描电镜观察支架空间结构良好,细胞与支架粘附良好,共培养第3天较第1天细胞数量明显增加.结论 脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构,适合BMSCs粘附、存活、增殖,该支架是良好的天然脊髓组织工程材料.当粘附率及细胞上架数基本达到最大时的最佳接种浓度为2×106/mL.     

髓核去细胞基质复合骨髓间充质干细胞体外构建组织工程髓核的研究?

目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)-髓核去细胞基质支架(NPAMS)复合体(rBMSCs-NPAMS)构建组织工程髓核。方法制备若干 NPAMS,接种 BMSCs 至 NPAMS 体外培养分为 NPAMS 组、实验组和正常对照组(正常髓核)。肉眼及显微镜观察复合体形态变化,并行扫描电镜(SEM)、苏木素-伊红(HE)染色、免疫组织化学、实时定量 PCR(qRT-PCR)、支架的生物力学等检测。结果肉眼下 rBMSCs-NPAMS 形态接近正常髓核;SEM 显示细胞在支架表面大量黏附、并向深部迁移,表面细胞密度比横截面细胞密度大;HE 染色表明随时间延长,rBMSCs-NPAMS 内细胞量递增,分布更广泛;免疫组织化学显示细胞外基质2型胶原(CollagenⅡ)分泌量随时间递增,且实验组 CollagenⅡ表达量大于 NPAMS 组,小于正常对照组;qRT-PCR结果：NPAMS 组未提取到 mRNA,实验组 CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA 相对表达量呈时间依赖性递增,但均小于正常对照组(P <0.01),支架与正常髓核在相同位移下的压缩载荷差异无统计学意义(P >0.05)。结论采用髓核体外 NPAMS复合 rBMSCs 可成功构建组织工程髓核。     

In vitro cartilage production using an extracellular matrix-derived scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Cartilage repair is a challenging research area because of the limited healing capacity of adult articular cartilage.We had previously developed a natural,human cartilage extracellular matrix （ECM）-derived scaffold for in vivo cartilage tissue engineering in nude mice.However,before these scaffolds can be used in clinical applications in vivo,the in vitro effects should be further explored.Methods We produced cartilage in vitro using a natural cartilage ECM-derived scaffold.The scaffolds were fabricated by combining a decellularization procedure with a freeze-drying technique and were characterized by scanning electron microscopy （SEM）,micro-computed tomography （micro-CT）,histological staining,cytotoxicity assay,biochemical and biomechanical analysis.After being chondrogenically induced,the induction results of BMSCs were analyzed by histology and Immunohisto-chemistry.The attachment and viability assessment of the cells on scaffolds were analyzed using SEM and LIVE/DEAD staining.Cell-scaffold constructs cultured in vitro for 1 week and 3 weeks were analyzed using histological and immunohistochemical methods.Results SEM and micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure.The majority of the cartilage ECM was found in the scaffold following the removal of cellular debris,and stained positive for safranin O and collagen Ⅱ.Viability staining indicated no cytotoxic effects of the scaffold.Biochemical analysis showed that collagen content was （708.2±44.7）μg/mg,with GAG （254.7±25.9） μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli （E） were （1.226±0.288） and （0.052±0.007） MPa in dry and wet conditions,respectively.Isolated canine bone marrow-derived stem cells （BMSCs） were induced down a chondrogenic pathway,labeled with PKH26,and seeded onto the scaffold.Immunofluorescent staining of the cell-scaffold constructs indicated that chondrocyte-like cells were derived from seeded BMSCs and excreted ECM.The cell-scaffold constructs contained pink,smooth and translucent cartilage-like tissue after 3 weeks of culture.We observed evenly distributed cartilage ECM proteoglycans and collagen type Ⅱ around seeded BMSCs on the surface and inside the pores throughout the scaffold.Conclusion This study stuggests that a cartilage ECM scaffold holds much promise for in vitro cartilage tissue engineering.     

体外构建组织工程心脏瓣膜动物实验初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉支架(decellularized porcine aortic valve scaffold，APAVS)与兔骨髓干细胞(rabbit bone marrow stromal cells，RBMSCs)体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法采用去垢剂-核酸酶消化法处理，去除猪主动脉瓣细胞成分，并做去细胞前后的形态学检查和生物力学测定；在去细胞支架上种植兔骨髓干细胞，行形态学检查和免疫组化测定。结果光镜及电镜证实，猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除，获得完整无细胞的纤维网状支架；瓣叶去细胞前后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化；种植的RBMSCs可在ACPAV表面形成一层连续的细胞层。结论种植RBMSCs于ACPAV上，可体外构造组织工程人工心脏瓣膜。     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(MSC)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法 抽取健康成年志愿者骨髓,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中采用全骨髓培养法,培养传代后改用含地塞米松(1×10^-8 mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)和维生素C(50 mg/L)的条件培养基培养,在相差显微镜和电镜下观察细胞形态,免疫组化检测Ⅰ型胶原,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶(AP)染色、von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内AP(碱性磷酸酶)含量变化,并进行统计学分析。结果 原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2~3周后,透射电镜下观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体和线粒体,细胞核较为幼稚。Ⅰ型胶原染色、AP及钙结节染色等均为强阳性;AP活性明显增强(P<0.05)。结论 MSC取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源,本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法之一。